Энзимология

Энзимология – раздел биохимии, изучающий строение, функционирование и регуляцию активности ферментов.

Энзимология (энзим + греч. logos учение, наука) – одна из основных областей современной биохимии. Предметом изучения энзимологии являются ферменты. Эта наука занимается описанием их свойств и структуры, а также анализом механизма катализа. Кроме того, предметом энзимологии является изучение механизмов регуляции активности ферментов, которые играют ключевую роль в жизнедеятельности клеток всех типов.

↑Задачи и основные направления энзимологии

Основной задачей энзимологии является описание ферментов и связанных с ними процессов. Ферменты – очень обширная группа белков и нуклеиновых кислот (РНК), катализирующих самые различные биохимические реакции.

Можно выделить следующие направления энзимологии:

1. определение структуры ферментов и в частности структуры активного центра;
2. описание механизмов катализа;
3. изучение механизмов регуляции активности ферментов, взаимодействия их с низко- и высокомолекулярными регуляторами (активаторами и ингибиторами);
4. использование ферментов в различных сферах человеческой деятельности.

На сегодняшний день открыто более 2000 различных ферментов, которые разделяются на 6 классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Классы в свою очередь делятся на подклассы и подподклассы. Многие ферменты выделены в изолированном виде, и для них определена первичная структура (аминокислотная последовательность) и взаимное расположение аминокислотных остатков в пространстве (трехмерная/третичная структура).

Ферменты широко используются в научных исследованиях (например, в генной инженерии), биотехнологии, фармакологии, пищевой, текстильной промышленности и других областях.

↑История энзимологии

Впервые термин «фермент» был предложен в XVII веке Жаном Баптиста ван Гельмонтом при изучении им процессов пищеварения. В XVIII – XIX веках благодаря опытам Реомюра и Спалланцани было выяснено, что переваривание мяса происходит под действием желудочного сока, также было устновено, что ферментативной активностью обладают многие биологические субстанции (слюна, экстракт дрожжей, зерен и др.), однако механизм действия долгое время оставался неизвестным. В конце XIX века ученые начали пытаться фракционировать различные экстракты для получения частично очищенных ферментов, в это время Вильгельмом Кюне был предложен термин «энзим».

Как только ферменты стали доступны в частично очищенном состоянии, началось изучение механизмов их действия. В 1890 году Эмиль Фишер предложил модель «ключ-замок». Согласно этой модели существует строгое соответствие между ферментом и его субстратом, благодаря которому образуется фермент-субстратный комплекс и происходит катализ. Основываясь на этой модели, в 1903 году Виктор Генри предложил первую математическую модель, описывающую механизм действия ферментов, в 1913 году Михаэлис и Ментен расширили и пересмотрели работу Генри и предложили описывать механизм ферментативного катализа уравнением, которое сейчас носит их имя (уравнение Михаэлиса-Ментен).

Дальнейшее изучение вопроса, каким образом ферменты способны ускорять химические реакции, привело к появлению теории переходного состояния. В 1948 году Лайнус Полинг предположил, что это достигается путем стабилизации переходного состояния при взаимодействии субстрата с активным центром фермента. Затем эта теория была подтверждена экспериментально. Согласно модели «ключ-замок» фермент лишь кратковременно взаимодействовал с субстратом, поэтому эта модель не могла объяснить стабилизацию переходного состояния. Это привело к появлению новой гипотезы. В 1958 году Даниел Кошланд предложил гипотезу, согласно которой исходно не существует строгого соответствия между субстратом и активным центром фермента, а при связывании субстрата активный центр меняет свою конформацию (модель индуцированного соответствия), при этом аминокислотные остатки занимают положение, необходимое для катализа реакции.

Начало изучение структуры ферментов связано с работой Джеймса Самнера, который в 1926 году закристаллизовал фермент уреазу. Это однозначно доказало, что ферментативной активностью обладают именно белки. Долгое время считалось, что ферментами могут быть исключительно белки. Однако в 1980-е годы Томас Чек обнаружил ферментативную активность у молекул рибонуклеиновых кислот (РНК).

Значительный шаг в изучении структуры ферментов был сделан с разработкой методов рентгеноструктурного анализа. К настоящему времени с помощью этого метода, а также метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) определены трехмерные структуры множества ферментов, как в свободном виде, так и в комплексе с субстратами. Это позволило не только однозначно определить аминокислотные остатки, участвующие в катализе, и механизм действия ферментов, но и проводить направленный мутагенез (с помощью генно-инженерных методов)  с целью повышения эффективности работы ферментов.

↑Методы энзимологии

Методы, используемые в энзимологии можно подразделить на три группы: первые относятся к выделению ферментов в чистом виде, вторые связаны с изучением механизмов катализа и кинетики ферментативных реакций, а третьи – с изучением структуры ферментов.

В первой группе стоит отметить такие широко распространенные методы, как фракционирование солями или органическими растворителями и хроматография. Современные методы позволяют достигать практически 100% степени очистки белков.

В настоящее время многие ферменты получают в большом количестве, синтезируя их с помощью методов генетической инженерии (рекомбинантные белки) в специальных штаммах бактерий или эукариотических клеточных культурах, однако в отдельных случаях данные подходы оказываются неприемлемыми.

Изучение кинетики ферментативных реакций позволяет предложить математические модели, позволяющие описать механизм катализа, анализировать влияние активаторов или ингибиторов фермента, искать новые вещества, влияющие на активность ферментов. Исследование кинетики реакции (и активности ферментов) можно проводить двумя способами: либо следить за убылью субстрата/прибылью продукта, останавливая реакцию через определенные промежутки времени, либо непрерывно наблюдать за одним из этих параметров. Для проведения подобных измерений используются манометрический, вискозиметрический, поляриметрический методы, методы ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), методы с применением радиоактивных изотопов. Однако, несомненно, наиболее широко распространенными являются спектроскопические методы исследования (спектрофотометрия, спектрофлорометрия и др.).

Основным методом изучения структуры ферментов является рентгеноструктурный анализ, позволяющий определить трехмерное расположение аминокислотных остатков в молекуле белка (третичную структуру). На основе кристаллографических структур ферментов в изолированном виде, в виде фермент-субстратного комплекса, и в комплексе с конечным продуктом реакции исследователи могут с большой степенью вероятности описать все процессы, которые происходят в процессе ферментативного катализа. Кроме того, совмещая рентгеноструктурный анализ с методом точечного мутагенеза (замены одних аминокислотных остатков на другие) можно направленно изменять свойства ферментов, например, увеличивать их активность или изменять специфичность. Кроме рентгеноструктурного анализа при исследовании структуры ферментов используются методы кругового дихроизма, ЯМР, ЭПР, масс-спектроскопии и другие.