Прикладная микробиология и биотехнология микроорганизмов

Человечество для своих нужд с давних пор широко использовало многие процессы, не догадываясь об их микробиологической природе. К такой «полезной» деятельности микроорганизмов можно отнести:

1. производство продуктов питания (кваса, пива, вина, спирта, уксуса, хлеба, молочнокислых, квашеных и соленых продуктов, рыбных и мясных продуктов ферментации);
2. производство пищевого и кормового микробного белка, пищевых добавок и кормов для животных;
3. получение индивидуальных химических веществ (растворителей, газов, ферментов, витаминов, органических и аминокислот, нуклеотидов, биополимеров, токсинов и т.д.), причем некоторые продукты вообще не могут быть получены химическим путем или их образование чрезвычайно дорого;
4. получение препаратов для медицины, ветеринарии и сельского хозяйства ( вакцин, сывороток, антибиотиков, алкалоидов, стероидов, гормонов, стимуляторов роста растений, микробных удобрений и т.д.);
5. участие микроорганизмов в ряде непищевых производств (биогидрометаллургии, изготовлении льняных волокон и табачных изделий);
6. переработка промышленных, сельскохозяйственных и бытовых отходов и очистка окружающей среды от загрязнений;
7. применение различных физиологических групп микроорганизмов (фототрофов, гидролитиков, бродильщиков, метилотрофов, метаногенов и т.д.) для создания замкнутых систем жизнеобеспечения на космических станциях и подводных лодках, находящихся в автономном плавании. В таких системах продукты жизнедеятельности человека служат питательным субстратом для микроорганизмов, производящих пищевой белок и кислород для дыхания;
8. использование микроорганизмов в качестве тест-систем, биосенсоров, моделей и инструментов научных исследований.

«Вредными» микробными процессами являются:

• порча пищевых продуктов;
• микробная коррозия промышленных и бытовых объектов и материалов;
• болезнетворность микроорганизмов для человека, животных и растений.

Следует иметь в виду, что «полезность» и «вредность» здесь рассматриваются именно по отношению к интересам человека, которые часто противоречат «интересам» природы в целом. Например, негативный для человека процесс порчи пищевых продуктов является лишь одной из сторон необходимого природного процесса деструкции органических веществ.

Создание любого микробиологического производства требует проведения предварительных лабораторных исследований. Они заключаются в поиске продуцентов, всестороннем изучении их свойств и оптимизации способов культивирования. Следующим этапом является масштабирование процесса и испытание его в промышленных условиях. При этом происходит постепенный переход от культивирования микроорганизмов в колбах к выращиванию в лабораторных ферментерах и затем – в промышленных установках большого объема. На таком заводе всегда функционирует микробиологическая лаборатория, сотрудники которой постоянно следят за состоянием микроорганизма-продуцента, способного видоизменяться в процессе производства и хранения. Они контролируют отсутствие посторонних микроорганизмов и бактериофагов, создают условия для поддержания высокой активности продуцента, следят за расщеплением продуцента на диссоциативные варианты, проводят периодические рассевы, отбирая высокопродуктивные колонии микроорганизма.

Микробиологические производства постоянно совершенствуются. Одним из путей является применение мутантных и генно-инженерных продуцентов. Например, для получения промежуточных соединений различных циклов (ЦТК) используют регуляторные мутанты, что позволяет накапливать органические и аминокислоты. Путем введения определенных генов в микробную клетку микроорганизмы могут быть превращены в продуцентов, производящих в сверхколичествах уникальные вещества с заданными свойствами (высокотермостабильные ферменты, искусственно сконструированные пептиды и белки, человеческие терапевтические агенты – инсулин, интерферон, эпидермальный фактор роста, поверхностный антиген вируса гепатита В и т.д.).

Для получения новых свойств у ряда продуцентов (дрожжей, плесневых грибов, стрептомицетов, лактококков) применяют метод «слияния протопластов». Для этого ферментативно удаляют клеточную стенку и частично растворяют ЦПМ под действием полиэтиленгликоля, что позволяет протопластам двух штаммов соединиться. В этих условиях их генетический материал подвергается рекомбинации, в результате полученный продуцент после регенерации клеточной стенки будет обладать новыми свойствами. Такие микроорганизмы менее стабильны, чем « дикие», поэтому необходимо применять соответствующие методы сохранения их активности. Из относительно новых способов хранения можно назвать лиофилизацию и хранение под жидким азотом.

Еще один технологический прием – это иммобилизация (закрепление) клеток и/или ферментов на (в) твердом носителе. В зависимости от природы носителя и механизма прикрепления иммобилизация бывает нескольких видов. При иммобилизации не только изменяется пространственное положение продуцента для удобства работы с ним, но и происходят значительные преобразования его жизнедеятельности за счет изменения свойств поверхностных структур клетки (в частности, ЦПМ) и образования новой поверхности раздела фаз. Примеры некоторых производственных процессов, основанных на использовании закрепленных клеток, приведены в таблице.

Таблица.

Производственные процессы, основанные на использовании иммобилизованных клеток.

Для повышения эффективности промышленных микробиологических процессов постоянно ведется работа по совершенствованию аппаратов для культивирования и полной автоматизации и компьютеризации процесса.

↑Приготовление пищевых продуктов с помощью микроорганизмов

Задолго до того, как были раскрыты микробиологические механизмы приготовления ряда продуктов, человек интуитивно научился использовать их в своей жизни. Издавна известны способы выпечки хлеба, приготовления кваса, вина, кисломолочных продуктов, квашеных овощей, некоторых мясных изделий и различных национальных кушаний. Например, у народов Севера с древних времен и до наших дней сохранился способ приготовления китового мяса, позволяющий им восполнять недостаток витаминов и аминокислот: сырое мясо заворачивают в шкуру и кладут под снег для «вызревания», происходит развитие микроорганизмов, образующих витамины, а также частичный гидролиз белка, дающий пептиды и аминокислоты. Некоторые продукты, в приготовлении которых задействован микробный метаболизм, представлены в таблице.

Таблица.

Пищевые продукты, при изготовлении которых используются микроорганизмы.

↑Приготовление кормов для сельскохозяйственных животных

Растительный материал для скармливания скоту (трава, сочные корма, а также капуста, огурцы и помидоры) можно сохранить в виде силоса с помощью молочнокислого брожения под действием природных популяций микроорганизмов, ассоциированных с наземными частями растений. Образующаяся при силосовании молочная кислота снижает рН корма и тем самым консервирует его. После силосования корма могут храниться довольно долго, но, как правило, их хранят до следующего урожая.

Материалы для хорошего силоса богаты углеводами и содержат относительно немного белка и воды. Это зеленая масса кукурузы, большинства зерновых, подсолнечника и турнепса. Медоносные травы, клевер, сено обычно силосовать труднее, а вика и горох не подвергаются силосованию.

Скошенную траву или сочные корма, приготовленные для силосования, режут, подсушивают, прессуют и закладывают в силосные башни, наземные хранилища или в силосные ямы для создания анаэробных условий. На начальном этапе силосования аэробные микроорганизмы и факультативно анаэробные энтеробактерии потребляют весь кислород в растительной массе. Это способствует преимущественному развитию и доминированию гомоферментативных лактобацилл, стрептококков, лактококков и лейконостока, которые образуют молочную кислоту и постепенно снижают рН до 4,0. При недостаточно быстром закислении может начаться рост Clostridium butyricum, который превращает лактат в масляную кислоту, придающую корму неприятный вкус и запах. Силос становится несъедобным для животных. Росту этого микроорганизма препятствует достижение значения рН ниже 4,5. На более поздних стадиях силосования преобладают кислотоустойчивые Lactobacillus plantarum, L. fermentum и L. brevis.

При производстве другого вида корма – сенажа, брожению подвергается подсушенная растительная масса с влажностью 50-65%. Несмотря на довольно высокое значение рН (около 5) гнилостные процессы происходят очень медленно, а процесс молочнокислого брожения активизируется за счет развития устойчивых к понижению активности воды представителей рода Lactobacillus. В сенаже содержатся умеренные количества лактата и ацетата.

В качестве дополнительного корма для животных могут быть использованы белково-витаминные концентраты (БВК) из биомассы различных микроорганизмов, выращенных на отходах пищевой промышленности. Некоторые индивидуальные вещества микробного происхождения (ферменты, аминокислоты, органические кислоты, витамины) также могут применяться как кормовые добавки, улучшающих структуру и усвоение кормов.

↑Микроорганизмы – продуценты индивидуальных веществ

Значительное количество индивидуальных веществ разного назначения (табл.) в настоящее время получают с помощью микроорганизмов. В их числе как простые органические и неорганические вещества, так и сложные соединения, химический синтез которых невозможен или крайне дорог.

Таблица.

Некоторые индивидуальные соединения, получаемые с помощью микроорганизмов.

Убеждение в конечности запасов полезных ископаемых и необходимости перехода на возобновляемые источники энергии диктует необходимость разработки производственных биотехнологических процессов получения спиртов и органических кислот наряду с уже имеющимся их химическим синтезом из нефти. Спирты (в частности, этанол) легко могут быть получены с помощью микроорганизмов, растущих как на пищевых субстратах и отходах пищевых производств, так и на техническом сырье. Давно известны процессы получения спирта путем спиртового брожения дрожжей на сахаристых субстратах и на древесных опилках, подвергнутых щелочному гидролизу. Применение в качестве продуцентов термофильных анаэробных бактерий, обладающих собственными мощными гидролазами, значительно ускоряет процесс, так как исключается стадия предварительного гидролиза сырья, а повышенная температура культивирования увеличивает скорость реакций. Использование устойчивых микробных ассоциаций способствует повышению активности и стабильности процесса получения спирта из растительной массы. Высокий выход конечного продукта может быть достигнут при непрерывном режиме культивирования с использованием иммобилизованных клеток микроорганизмов.

Ряд органических кислот и аминокислот получают с использованием плесневых грибов и коринебактерий, осуществляющих неполные окисления, причем L-формы аминокислот могут быть синтезированы исключительно микробиологическим путем.

Молекулярный водород в настоящее время рассматривают как перспективное возобновляемое биотопливо. Этот газ выделяется при некоторых видах брожения и при азотфиксации. В качестве продуцентов водорода изучают фототрофные микроорганизмы, обладающие нитрогеназным комплексом (например, пурпурные бактерии и цианобактерии). Они способны расти при освещении на очень простых средах. При иммобилизации клеток на пористом стекле или внутри гранул различных гелей может быть достигнуто значительное повышение выхода газообразного водорода.

Метан в смеси с углекислым газом (биогаз) может быть получен при микробиологической переработке растительного и животного сырья в сельском хозяйстве или при уничтожении промышленных и бытовых отходов. Такая конверсия является наиболее эффективным способом преобразования отходов, сопровождающаяся получением полезных продуктов. Она осуществляется с помощью естественно сложившихся метаногенных микробных сообществ в анаэробных условиях и основана на тесных взаимодействиях микроорганизмов разных систематических и физиологических групп. Процесс начинается с гидролиза биополимеров растительного и животного сырья и отходов внеклеточными ферментами бактерий рода Clostridium. Продукты гидролиза подвергаются брожениям разных типов под действием энтеробактерий, клостридий, молочнокислых бактерий с образованием смеси летучих жирных кислот, спиртов и газов. Эти вещества используются бактериями-синтрофами, продуцирующими субстраты метаногенеза (Н₂, СО₂ и ацетат). Завершающую стадию осуществляют водородотрофные и ацетокластические метаногенные археи, выделяя биогаз. Отходы сельского хозяйства перерабатываются в биогаз в специальных резервуарах (метантенках) при 54-56^оС. Некоторое количество кислорода, содержащееся в загружаемом сырье, быстро потребляется естественной аэробной и факультативно анаэробной микробиотой сельскохозяйственных отходов. Повышенная температура в метантенке позволяет увеличить скорость переработки и способствует обеззараживанию перерабатываемых отходов. Конверсию жидких отходов, в том числе бытовых и промышленных стоков, проводят в специальных анаэробных реакторах с высокой концентрацией агрегированной биомассы и с восходящим током жидкости. Использование микроорганизмов для получения биогаза позволяет комплексно решать проблемы малой энергетики, получения новых возобновляемых энергоресурсов и перехода к безотходным технологиям. 

Микробиологические процессы играют существенную роль в фармацевтической промышленности при производстве витаминов, ферментов и стероидных гормонов. Так, для получения витамина В₂ (рибофлавина) используют фитопатогенные грибы, образующие его в больших количествах и выделяющие избыток в среду. Бактерии родов Pseudomonas и Propionibacterium синтезируют сложный по химической структуре витамин В₁₂, применяемый в медицине. При экстракции осадков метантенков получают кормовой препарат витамина В₁₂.

Микробные ферменты применяют в различных отраслях человеческой деятельности. Например, амилазы, протеазы, липазы и целлюлазы, образуемые плесневыми грибами, пектиназы бактерий рода Erwinia и инвертазу пекарских дрожжей используют в пищевой промышленности. Протеазы грибов, стрептомицетов и бацилл добавляют к стиральным порошкам для удаления белковых загрязнений. В медицине нашли применение лекарственные формы стрептокиназы бактерий рода Streptococcus и коллагеназы представителей рода Clostridium, используемые для заживления ран, а также грибные амилазы, протеазы и липазы, способствующие нормализации пищеварения. Микробные ферменты применяют при лабораторной диагностике в медицине и в научных исследованиях в качестве высокоспецифичных реагентов.

В промышленности, медицине и научных исследованиях в качестве загустителей, смазочных материалов, гелей для иммобилизации, молекулярных сит и сорбентов используются разнообразные микробные полисахариды. Поли-β-алканоаты (природные термопластики) добавляют при изготовлении в полимерные упаковочные материалы, что способствует их более быстрой микробной деструкции в окружающей среде.

Основными продуцентами при производстве антибиотиков служат плесневые грибы рода Penicillium и бактерии родов Streptomyces и Bacillus. В связи с возникновением множественной лекарственной устойчивости среди патогенных микроорганизмов микробиологическая стадия получения антибиотиков часто продолжается стадией их химической модификации. Исследователи постоянно ведут поиск новых антибиотических веществ и их продуцентов.

Стероидные гормоны широко используются в медицине как регуляторы метаболизма животных и человека. Потребности в этих препаратах не покрываются выделением их из животного сырья, так как в животном организме стероидов синтезируется крайне мало. Использование дешевого растительного сырья с последующей химической модификацией растительных стеринов требует проведения тонкой трансформации, затрагивающей только один-два определенных атома стероидного ядра, что крайне дорого и неэффективно. Однако такие реакции способны проводить некоторые микроорганизмы, специфически отщепляя или присоединяя атомы и группы в нужном положении и тем самым превращая низкоактивные стероиды растительного происхождения в гормональные препараты. В настоящее время ряд штаммов артробактеров, микобактерий, коринебактерий и плесневых грибов применяют для получения преднизолона, кортизона и гидрокортизона. При производстве стероидных гормонов микробиологический процесс используют как одну из стадий синтеза препарата. Растительные стероиды, нерастворимые в воде, добавляют в культуру в виде тонкодисперсной суспензии в фазе замедления роста микроорганизма. Микробные клетки прикрепляются к частицам фитостеринов, а трансформированные продукты выделяются в среду. Для получения некоторых человеческих гормонов и факторов применяют генно-инженерные технологии, когда нужные гены вводят в геном микроорганизма-продуцента.

Гиббереллины, полученные микробиологическим путем, успешно применяют в сельском хозяйстве для стимуляции роста растений. Исследования последнего времени показывают, что многие ризосферные микроорганизмы могут быть источником ряда фитогормонов.

↑Микробиологические процессы получения биопрепаратов для сельского хозяйства

Биопрепараты комплексного действия на основе микроорганизмов рассматриваются как альтернатива различным химическим препаратам (минеральным удобрениям, пестицидам и т.д.), применяемым в земледелии.

Для предпосевной обработки семян бобовых растений во многих странах используют препараты клубеньковых бактерий. Наиболее эффективен этот прием в случае внедрения новых культур бобовых на вновь осваиваемых посевных площадях, так как позволяет обеспечить тесный контакт потенциальных симбионтов, обеспечивает быстрое образование клубеньков и эффективную симбиотическую азотфиксацию. Обработка семян препаратами при посеве давно возделываемых бобовых культур на прежних посевных площадях также дает прибавку к урожаю за счет обеспечения контакта растения с высокоактивными видоспецифичными штаммами клубеньковых бактерий. Применение таких биопрепаратов позволяет не только снизить дозы минеральных азотных удобрений, но и положительно влияет на качество урожая бобовых, повышая содержание белка и витаминов в зерне. Препараты на основе клубеньковых бактерий имеют разные названия (нитрагин, нитразон, ризоторфин и др.). При их приготовлении используют стерильные или нестерильные носители ( почва, торф), содержащие необходимые питательные вещества, в которые вносят суспензию клубеньковых бактерий, иногда выдерживают препарат в термостате для подращивания культуры, а затем фасуют в тару различного объема. Перед посевом препарат разводят водой и обрабатывают им семена.

Использование в качестве биопрепаратов культур микроорганизмов ризоферы и ризопланы обусловлено не только их способностью к ассоциативной азотфиксации, но и выработкой биологически активных по отношению к растениям веществ (стимуляторов роста, витаминов, антибиотических соединений, активных против фитопатогенных микроорганизмов). Для приготовления препаратов используют чистые или смешанные культуры представителей родов Azotobacter, Azospirillum, Agrobacterium, Arthrobacter, Enterobacter, Bacillus, Pseudomonas и др. Водной суспензией препарата обрабатывают поверхность семян или корневую систему растений. Как правило, положительные стабильные результаты применение препаратов дает на хорошо окультуренных, богатых органикой почвах (в теплицах, оранжереях). В настоящее время предлагается широкий спектр препаратов под разными названиями и на основе разных микроорганизмов (азотобактерин, азоризин, агрофил, мизорин, ризоагрин, псевдобактерин и т.д.).

Цианобактериальные препараты применяют в ряде стран на обводненных и затопляемых почвах, например, при выращивании риса. Массу цианобактерий получают в специальных бассейнах, внося туда маточную культуру (обычно это представители родов Anabaena и Nostoc). В некоторых странах Азии в качестве «зеленого удобрения» используют водный папоротник азолла, несущий на листьях симбиотического диазотрофа Anabaena azollae. Размножают растение в небольших водоемах, а потом запахивают в почву рисовников, либо переносят на поверхность воды рисовых полей. Отмирающая масса папоротника минерализуется, и соединения азота становятся доступными растениям риса.

Ряд биопрепаратов применяют для активизации микробиологических процессов в почвах. Это, например, фосфоробактерин на основе спор Bacillus megaterium для повышения доступности фосфора для растений; бактогумин, содержащий смешанную культуру микроорганизмов разных физиологических групп, для изготовления биологически активных грунтов; комплексные биопрепараты почвенных бактерий для применения под овощные и плодовые культуры, в основном, в защищенном грунте и т.д.

Для защиты сельскохозяйственных растений от поражения фитопатогенными грибами препараты на основе микроорганизмов-антагонистов (обычно бактерий родов Pseudomonas и Azotobacter и грибов рода Trichoderma) вносят в почву или обрабатывают ими семена и корни высаживаемых растений. К сожалению, в природной обстановке активность таких препаратов существенно снижается, так как вносимые микроорганизмы не всегда способны выдержать конкуренцию с естественной микробиотой почвы.

Для борьбы с вредителями сельского хозяйства широко применяют микробиологические методы. С помощью бактерий и грибов получают энтомопатогенные препараты, обладающие избирательной токсичностью для личинок и взрослых особей многих насекомых, но не опасные для других членов экосистемы и человека. Например, белковые кристаллы Bacillus thuringiensis вызывают паралич у личинок перепончатокрылых при попадании в их кишечник. Энтомопатогенный препарат представляет собой высушенные клетки бацилл в фазе начала споруляции, когда образуются белковые кристаллы токсина. Перед применением порошок разводят в воде и распыляют на листья растений. Для защиты растений также используют культуры возбудителей инфекционных болезней насекомых и грызунов, вызывающих эпизоотии среди этих вредителей, но не патогенных для других животных.

В традиционном земледелии большинство органических остатков превращается в органические удобрения в результате компостирования. Компостирование – это увеличение скорости природной минерализации отмершего органического вещества. В настоящее время компостирование завоевывает все большую популярность в развитых странах как альтернатива промышленным и бытовым свалкам больших городов. Компостирование приводит к:

1. уменьшению объема отходов;
2. снижению содержания органического вещества в отходах;
3. улучшению их физических характеристик, что позволяет складировать отходы более компактно;
4. уменьшению количества микроорганизмов, патогенных для растений, животных и человека, а также семян сорняков;
5. сокращению площадей, отчуждаемых под полигоны для свалок.

При компостировании сначала отделяют биодеградабельную часть отходов от не перерабатываемой микроорганизмами (пластика, металлов, стекла). Оставшаяся часть органических отходов смешивается с порцией старого компоста («посевной материал») и с органическими веществами, которые перерабатываются медленно (щепа, нарезанная бумага, подсолнечная шелуха), для создания рыхлой структуры и лучшей вентиляции компоста. Компостирование осуществляют в длинных, но не очень высоких (до 2 м) грядах, которые время от времени перемешивают для более равномерного прохождения процесса. Появления неприятного запаха (сероводорода, меркаптанов) избегают, накрывая компостные кучи слоем почвы.

↑Микробное выщелачивание металлов

Способность некоторых микроорганизмов окислять восстановленные соединения серы и металлов применяют в биогидрометаллургии бедных руд. Суспензия таких микробов, обогащенная кислородом, осуществляет реакции, переводящие металл (Ме) в растворенное состояние:

FeS₂ + 3½O₂ + H₂O → FeSO₄ + H₂ SO₄

S⁰ + 1½O₂ + H₂O → H₂ SO₄

2FeSO₄ + ½O₂ + H₂ SO₄→ Fe₂(SO₄)₃ + H₂O

MeS + 2Fe³⁺ → Me²⁺ + 2Fe²⁺ + S⁰

Полученный раствор концентрируют и осаждают из него металл. В технологических условиях процесс проходит под действием микробного сообщества, включающего грамотрицательные ацидитиобациллы и лептоспириллы, грамположительные сульфобациллы и археи ацидианусы, металлосферы, сульфолобусы и ферроплазмы. В зависимости от условий один или несколько штаммов в сообществе численно преобладают. Все участвующие в процессе микроорганизмы обладают устойчивостью к высоким концентрациям металлов.

Извлечение (выщелачивание) металлов с помощью микроорганизмов осуществляют тремя основными способами. При кучном выщелачивании отвал бедной руды орошают аэрируемой суспензией микроорганизмов. Из стекающего с кучи раствора осаждением или электролизом извлекают металл, а раствор вновь направляют на орошение руды. При подземном выщелачивании обогащенную кислородом суспензию микроорганизмов закачивают в скважину. При чановом выщелачивании сложные руды и концентраты перерабатывают в специальных установках, обеспечивающих непрерывный проточный режим. Микробиологические процессы используют при получении меди, урана, марганца, а также для освобождения олова, серебра и золота из кристаллов сульфидных минералов, содержащих мышьяк.

↑Биологическая обработка органических отходов

Жидкие органические отходы – это сточные воды бытовых, сельскохозяйственных и промышленных предприятий, к полужидким относятся полужидкий навоз и осадки сточных вод, а твердые формируются из бытового мусора и подстилочного навоза. В зависимости от характера производства состав загрязнений в промышленных стоках может сильно различаться. Обработка сточных вод заключается в практически полном удалении из них органического вещества. В полужидких и твердых отходах удаляется прежде всего быстро разлагаемая часть органических соединений, а оставшаяся часть стабилизируется. При аэробном разложении органических отходов примерно половина углерода и энергии расходуется на прирост биомассы микроорганизмов-деструкторов, а другая половина рассеивается в виде тепла. Анаэробное разложение с образованием метана приводит к переводу почти 90% углерода и энергии органических веществ в биогаз и только 5-8% расходуется на построение микробных клеток.

В настоящее время активно разрабатываются и используются аэробные процессы, позволяющие с высокой скоростью удалять даже низкие концентрации органических веществ. Существенным недостатком аэробных технологий, особенно при обработке концентрированных сточных вод, являются высокие энергозатраты на аэрацию. Проблемы связаны также с образованием большого количества микробной биомассы, имеющей очень низкую водоотдающую способность. Чтобы использовать эту биомассу в качестве удобрения, необходимо снизить в ней содержание воды. Для этого используют длительную естественную сушку на значительных по территории иловых площадках, что приводит к ухудшению экологической обстановки. Некоторые сложные ксенобиотики на воздухе полимеризуются в трудноразлагаемые вещества, а продукты их аэробного разложения часто более токсичны, чем исходные загрязнители. Ароматические соединения понижают поверхностное натяжение водных растворов и могут являться причиной неконтролируемого пенообразования в аэрируемых водоёмах. Некоторые из них летучи и токсичны и при аэробном методе очистки способны загрязнять воздух.

При анаэробной обработке преимуществами являются незначительное образование биомассы, возможность удалять высококонцентрированные вещества и попутное образование возобновляемого источника энергии (метана). Оказалось, что в анаэробных условиях микроорганизмы способны разрушать органические соединения, содержащие ароматические и конденсированные циклические структуры. Полного разложения ксенобиотиков удается добиться при использовании структурированных микробных сообществ, содержащих микроорганизмы различных физиологических групп. Поскольку при низких концентрациях органического загрязнителя анаэробный процесс не всегда эффективен, для глубокой очистки применяют комбинацию бескислородной и аэробной обработки.

В современных процессах очистки, в основном, применяют естественно складывающиеся микробные сообщества. Видовой состав таких сообществ и взаимодействие микроорганизмов в них изучены недостаточно, что тормозит массовое применение биоремедиации. Изучение метаболических путей в микробных сообществах в перспективе позволит создать ассоциации микроорганизмов, способные разрушать весь набор загрязнителей.

Микробиологическая очистка сточных вод

Самыми простыми способами очистки сточных вод является их отстаивание и фильтрация. Эти процессы происходят в системе неглубоких водоемов (прудов и каналов), где микроорганизмы находятся в осадке и во взвешенном состоянии. Естественная фильтрация происходит через песок и глину. Иногда используют природные низины, затопляемые сточными водами ( поля орошения и искусственные болота). В очистных водоемах часто выращивают водные растения, в ризосфере которых формируется микробное сообщество, участвующее в биоремедиации. К простым очистным сооружениям относятся струйные и дисковые биофильтры. Струйные биофильтры – это емкости или наклонные каналы, заполненные пористым материалом. На таком наполнителе формируется микробная биопленка. Ее основу составляют выделяющие слизь зооглеи. Микробное сообщество, погруженное в слизистый матрикс, состоит из бактерий, грибов, простейших. Сточные воды медленно просачиваются через наполнитель (керамзит, щебень) и собираются внизу. Дисковые биофильтры представляют собой медленно вращающиеся диски, наполовину погруженные в протекающую воду. Поверхность диска покрыта биопленкой, в верхнем слое которой обитают аэробные и факультативно анаэробные, а в нижнем – анаэробные микроорганизмы. При медленном вращении части диска последовательно соприкасаются с кислородом воздуха и погружаются в сточную воду, что приводит к чередованию аэробных и анаэробных процессов.

При централизованной очистке сточных вод применяют принудительную аэрацию и поддерживают высокую плотность микробной популяции. Городские очистные сооружения представляют собой крупные промышленные предприятия, перерабатывающие туалетные, кухонные, ливневые воды и нетоксичные стоки промышленных предприятий. Процесс аэробной очистки сточных вод на основе активированного ила состоит из 3-4 стадий. На первой стадии при проходе воды через решетку, песколовку и отстойник удаляются твердые включения. Вторая стадия заключается в биологической очистке воды с помощью активированного ила. Растворенные и суспендированные загрязнения окисляются сложным микробным сообществом в открытом бассейне (аэротенке) с принудительной подачей воздуха и интенсивным перемешиванием. Микроорганизмы активно растут и используют до 99% загрязнений. Обработанная вода и микробная биомасса разделяются во вторичном отстойнике. Из него микробный ил возвращается обратно в аэротенк, а вода направляется на третью стадию химической и биологической доочистки от азота и фосфора. Азот присутствует в виде аммония, нитрата и нитрита. При интенсивной аэрации и низкой концентрации органических веществ нитрифицирующие бактерии превращают аммоний в нитрат. В условиях периодического ограничения доступа кислорода денитрификаторы проводят восстановление нитрата в молекулярный азот. Фосфаты накапливаются некоторыми грамположительными бактериями и акинетобактерами и могут быть удалены с осадком ила. Другим широко распространенным методом удаления фосфора является его химическое осаждение в виде фосфатов железа и алюминия. Четвертой стадией очистки может быть дезинфекция соединениями хлора или озоном. Концентрированные осадки сточных вод из всех отстойников подвергаются анаэробной переработке в метантенке. Уплотненный осадок метантенка и твердые включения направляются на полигоны захоронения твердых бытовых отходов или используется в качестве удобрения.

В микробное сообщество активированного ила входят разнообразные микроорганизмы, многие из которых имеют слизистые капсулы (зооглеи, лейкотрикс, тиотрикс и др.). Ил содержит много микроорганизмов, не поддающихся лабораторному культивированию и определенных с помощью молекулярно-биологических методов. В сообщество ила входят паракокки, каулобактеры, гифомикробии, псевдомонады, цитофаги, флавобактерии, флексибактеры, коринебактерии, артробактеры, нокардии, родококки, бациллы, клостридии, стафилококки, лактобациллы и др. Численность патогенных бактерий обычно мала. Простейшие представлены инфузориями и амебами. Микроорганизмы активированного ила образуют хлопьевидные агрегаты, способные к осаждению. При наличии избытка нитчатых форм может происходить вспухание ила, когда образуются гигантские пенообразные хлопья, выносимые с очищенной водой. Такой ил содержит большое количество нитчатых бактерий (сферотилус, беггиатоа, тиотрикс) и бацилл, а также мицелий актиномицетов и плесневых грибов.

Анаэробная обработка применяется в случае концентрированных сточных вод. Поскольку рост микробного сообщества в анаэробных условиях замедлен, то в реакторе необходимо удерживать максимальное количество биомассы. Для этого используют реакторы с фиксированной загрузкой, представляющий собой анаэробный биофильтр с верхней или нижней подачей воды. Наиболее эффективен реактор с восходящим потоком воды через взвешенный слой ила. Анаэробное микробное сообщество в этом случае представлено плотными гранулами, основой которых являются клетки метаногенов. В сильно концентрированных стоках формируются мелкие рыхлые агрегаты, в которых клетки бактерий погружены в межклеточное вещество псевдоткани метаносарцины. Плотные гранулы образуются на основе нитей метаносаеты, между которыми расположены клетки других членов сообщества. Таким образом, образование метаногенных гранул – это пример самоиммобилизации микроорганизмов, для которых тесное соседство необходимо для межвидового переноса промежуточных веществ.

Полужидкие отходы, а также растительные и пищевые остатки перерабатываются обычно в метантенках – закрытых резервуарах разного объема. Длительность процесса составляет от 2 до 5 недель при температуре 30-35 или 50-55^оС. В больших метантенках содержимое перемешивают с помощью мешалок или путем продувки нагретого пара. В результате получается хорошее обеззараженное удобрение.

↑Биоконверсия растительного сырья и отходов сельского хозяйства в биогаз и растворители.

Микробиологическая конверсия растительного сырья – наиболее эффективный способ осуществить управляемую переработку целлюлозо- и крахмалсодержащих сельскохозяйственных продуктов и отходов в полезные субстанции. При этом решается ряд задач по переходу к безотходным технологиям и, в частности, проблемы малой энергетики и использования новых возобновляемых энергоресурсов, а также защиты окружающей среды.

Спирты (в основном, этанол) относятся к традиционным энергосоединениям, для получения которых используются микроорганизмы (табл. 26).

Таблица 26.

Производство спирта может быть основано не только на использовании пищевых субстратов и отходов пищевых производств, но и на техническом сырье, способном подвергаться гидролизу, в том числе неферментативному, с образованием сахаров (например, на древесных опилках). Использование термофильных анаэробных бактерий позволяет не только ускорить проведение процесса биоконверсии, но и исключить стадию предварительного гидролиза сырья, так как эти микроорганизмы способны сами продуцировать мощные гидролазы. Таким образом, становится возможным проведение непосредственной переработки растительного сырья сразу в этанол. Повышение активности и стабильности процесса получения спирта из растительной массы может быть достигнуто путем применения устойчивых микробных ассоциаций.

Конверсия сельскохозяйственных отходов в биогаз осуществляется под действием естественно сложившихся метаногенных микробных сообществ в анаэробных условиях. Такие микробные сообщества основаны на синтрофных взаимодействиях микроорганизмов разных систематических и физиологических групп, осуществляющих межвидовой перенос интермедиатов (водорода, ацетата, формиата). Процесс начинается с гидролиза биополимеров растительного сырья и отходов внеклеточными ферментами бактерий рода Clostridium. Далее продукты гидролиза подвергаются брожениям разных типов под действием микроорганизмов сем. Clostridiaceae, Enterobacteriaceae, Lactobacillaceae, Streptococcaceae, и образуется смесь летучих жирных кислот, спиртов и газов. Далее следует синтрофная стадия, на которой продукты брожения используются бактериями родов Synthrophomonas и Synthrophobacter с образованием субстратов метаногенеза (Н₂, СО₂ и ацетата). Завершающая стадия процесса приводит к образованию метаногенными археями биогаза.

↑Переработка твердых отходов

К твердым загрязнителям относятся бытовые отходы, твердые включения сточных вод и сельскохозяйственные остатки. Твердые бытовые отходы (ТБО) представлены пищевыми и туалетными остатками, бумагой и инертными материалами (стеклом, металлом, пластиком и т.д.). Рациональному использованию ТБО способствует их раздельный сбор.

Самым простым методом утилизации твердых бытовых и промышленных отходов является их захоронение в естественных понижениях рельефа местности (оврагах, карьерах) и сваливание с последующей засыпкой слоем грунта. Захоронение может быть произведено на специальных полигонах ТБО с уплотненным глинистым дном. Слои мусора на полигонах периодически уплотняют и пересыпают слоем грунта. Высота мусорных куч может достигать 20-40 м. Микроорганизмы попадают в кучу вместе с отходами и из почвы и грунта. Разложение отходов происходит медленно (30-50 лет), при этом разрушается только 30% захороненной органики. В погребенных отходах анаэробное разложение сдерживается низкой влажностью и небольшой плотностью популяции микроорганизмов-деструкторов. В микробном сообществе свалки присутствуют группы микроорганизмов, осуществляющих разные стадии превращения сложных полимерных соединений в биогаз. В период активного метаногенеза происходит разогрев массы до 30-55^оС. В верхней части кучи развиваются аэробные микробы, среди которых особое значение имеют метанотрофные бактерии. Благодаря их активности значительная часть образуемого в анаэробной зоне свалки метана не попадает в атмосферу. Тем не менее, свалки и полигоны ТБО вносят существенный вклад в парниковый эффект. На современных полигонах ТБО отходы герметически отделены от окружающей среды, а биогаз собирается и используется как топливо.

В сельской местности органические отходы традиционно компостируются для получения удобрений. Компостирование является аэробным микробным процессом переработки органических веществ с выделением тепла. В настоящее время в развитых странах все большую популярность приобретает компостирование ТБО как альтернатива промышленным и бытовым свалкам больших городов. Перед закладкой разлагаемую часть отходов отделяют от инертных материалов и смешивают с целлюлозосодержащими трудноразлагаемыми остатками (щепой, шелухой, опилками).

В ряде стран практикуют твердофазную анаэробную переработку, когда ТБО загружают в специальные реакторы для получения метана. Процесс может быть периодическим или непрерывным. При непрерывной обработке ТБО отходы предварительно измельчаются и подогреваются паром до 50^оС. Загрузка отходов происходит сверху, а выгрузка переработанной смеси – из нижней части цилиндрического реактора. Процесс обработки длится три недели при 55^оС. После отжима воды продукт подвергается 10-тидневному аэробному компостированию для получения удобрения.

↑Биоремедиация загрязненных объектов природной среды

Доступность вещества-загрязнителя в различных природных местообитаниях для способных разрушить его микроорганизмов во многом будет зависеть от физико-химических свойств данного местообитания. Свойства водной экосистемы довольно легко поддаются лабораторному моделированию, в то время как почва может значительно изменять характеристики процессов, разработанных в лаборатории. Почву и подстилающие ее грунты следует рассматривать как сочетания локальных областей с разными наборами физико-химических свойств. Поэтому при пространственной миграции загрязняющего вещества существенно меняются факторы, влияющие на процесс его биоразрушения. Загрязнитель может связываться с веществами гумуса и минеральных частиц за счет сорбции или химических реакций, тем самым становясь малодоступным для микроорганизмов и накапливаясь в различных участках. Почвенные частицы могут создавать физический барьер между клетками и чужеродными веществами путем избирательной фильтрации через микропоры. Одним из широко распространенных и опасных загрязнителей природных экосистем является нефть, которая добывается в больших количествах и транспортируется на значительные расстояния. В состав нефти и нефтепродуктов входят линейные и разветвленные углеводороды с разным числом атомов углерода, соединения с бензольными кольцами и различными заместителями, полициклические ароматические углеводороды. Микроорганизмы, способные использовать разные фракции нефти присутствуют в любом типе почвы. Это представители акинетобактеров, бацилл, артробактеров, цитофаг, клостридий, коринебактерий, флавобактерий, микрококков, микобактерий, нокардий, родококков, псевдомонад, мицелиальных грибов аспергиллов, пенициллов, мукоров, фузариумов, триходерм и дрожжей кандида, эндомицетов, родоторул, торулопсисов и сахаромицетов.

В настоящее время загрязненные почвы и грунты либо обрабатывают на месте, либо вывозят и подвергают обработке на специальных предприятиях. В первом случае наряду с физическим устранением загрязнения (промыванием, счищанием) применяют и биоразрушающую способность микроорганизмов. Один из методов – стимулировать развитие представителей естественной микробиоты данной почвы, способных разлагать загрязнитель. Для активизации этих микроорганизмов в почву вносят доступные источники углерода и энергии (например, этанол), окислители (кислород, нитраты), источники азота и фосфора и вспомогательные вещества (например, эмульгаторы для гидрофобных соединений). Аэрация почвы достигается вспашкой и подачей воздуха под давлением через перфорированные трубы. Уничтожение загрязнителя требует достаточно длительного времени, однако без таких добавок процесс очищения может проходить десятилетиями. Так, при разливе нефти на Аляске добавление азота и фосфора сократило процесс разложения углеводородов до 1,5 лет. Вторым приемом очистки является внесение микроорганизмов с уже известной биоразрушающей активностью к веществам-загрязнителям. Эффективность их воздействия во многом зависит от возможности создания условий, оптимальных для проявления активности. В природных экосистемах это не всегда достижимо, так как для них характерны существенные колебания физико-химических факторов. Тем не менее, разработан целый ряд микробных препаратов на основе чистых и смешанных культур углеводородокисляющих микроорганизмов. Поскольку нет микроорганизма, способного разрушать абсолютно все химические компоненты нефти, то такие препараты, как правило, содержат виды, имеющие взаимодополняющие активности. Наряду с микробными клетками в препарат включают соединения, поддерживающие жизнедеятельность микроорганизмов в месте загрязнения. Применение таких препаратов целесообразно в свежих загрязнениях, пока естественная углеводородокисляющая микробиота не достигла значительной плотности.

Очистку с вывозом загрязненного грунта применяют в опасных случаях, чтобы не допустить проникновения загрязнителя в поверхностные и грунтовые воды. При этом удаляют почвенный слой и производят выемку грунта. Снятую почву укладывают в виде штабеля и аэрируют с помощью перфорированных труб для окисления кислородом воздуха. Растворимые загрязнения удаляются промывкой водой. При сжигании почва превращается в минерализованный продукт. Полную выемку грунта производят на территориях, занятых свалками и полигонами ТБО, при намерении использовать их под строительство или для хозяйственных нужд. Грунт просеивают для отделения неразложившихся частиц, которые сжигаются или перезахораниваются. Нетоксичный просеянный грунт можно применять для озеленения.

Нефть и нефтепродукты попадают в водоемы при авариях на нефтяных скважинах, разливах во время перевозок, с судов и из нефтехранилищ. Опасность разлива нефти в этих случаях определяется быстротой ее распространения по большой площади и образованием поверхностной пленки. Пленка нарушает газообмен воды и атмосферы, что приводит к гибели фитопланктона, осуществляющего первичную продукцию органического вещества и кислорода в водоемах. Компоненты нефти оказывают токсическое действие на живые организмы. Тяжелые фракции могут откладываться в прибрежной зоне и в донных осадках. В воде морей и пресных водоемов присутствуют микробы-деструкторы нефти в концентрациях 10⁶-10⁷ клеток на 1 л. Это неспоровые бактерии, актинобактерии, мицелиальные грибы и дрожжи. Очистные мероприятия заключаются прежде всего в ограничении распространения нефтяного пятна и механическом сборе нефтяной пленки с поверхности воды. Микробиологическая биоремедиация осуществляется на месте загрязнения путем стимуляции естественной углеводородокисляющей микробиоты или с помощью вносимых микробных препаратов.

Особенностью процессов биоремедиации природных местообитаний при загрязнении ксенобиотиками является незначительная способность естественной микробиоты к их использованию при первом контакте. Однако многими исследователями отмечено явление адаптации микроорганизмов в природных и искусственных экосистемах, когда при повторном попадании данного соединения микробное сообщество осуществляет его переработку с большей скоростью и при более высоких концентрациях.