Генетическая инженерия

Генетическая инженерия -совокупность методов биохимии и молекулярной генетики, с помощью которых осуществляется направленное комбинирование генетической информации любых организмов. Генетическая инженерия (Г. и.) позволяет преодолевать природные межвидовые барьеры, препятствующие обмену генетической информацией между таксономически удалёнными видами организмов и создавать клетки и организмы с несуществующими в природе сочетаниями генов, с заданными наследуемыми свойствами.

Главным объектом генно-инженерного воздействия является носитель генетической информации – дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), молекула которой обычно состоит из двух цепей. Строгая специфичность спаривания пуриновых и пиримидиновых оснований обусловливает свойство комплементарности – взаимного соответствия нуклеотидов в двух цепях. Создание новых сочетаний генов оказалось возможным благодаря принципиальному сходству строения молекул ДНК у всех видов организмов, а фактическая универсальность генетич. кода делает возможной экспрессию чужеродных генов (проявление их функциональной активности) в любых видах клеток. Этому способствовало также накопление знаний в области химии нуклеиновых кислот, выявление молекулярных особенностей организации и функционирования генов (в т.ч. установление механизмов регуляции их экспрессии и возможности подчинения генов действию «чужих» регуляторных элементов), разработка методов секвенирования ДНК, открытие полимеразной цепной реакции, позволившей быстро синтезировать любой фрагмент ДНК.

Важными предпосылками для появления Г.и. явились: открытие плазмид, способных к автономной репликации и переходу из одной бактериальной клетки в другую, и явления трансдукции – переноса некоторых генов бактериофагами, что позволило сформулировать представление о векторах – молекулах-переносчиках генов.

Огромное значение в развитии методологии Г.и. сыграли ферменты, участвующие в преобразовании нуклеиновых кислот: рестриктазы (узнают в молекулах ДНК строго определенные последовательности (сайты) и «разрезают» двойную цепь в этих местах), ДНК-лигазы (ковалентно связывают отдельные фрагменты ДНК), обратная транскриптаза (синтезирует на матрице РНК комплементарную копию ДНК, или кДНК) и др. Только при их наличии создание искусств. структур стало технически выполнимой задачей. Ферменты используются для получения индивидуальных фрагментов ДНК (генов) и создания молекулярных гибридов – рекомбинантных ДНК (рекДНК) на основе ДНК плазмид и вирусов. Последние доставляют нужный ген в клетку хозяина, обеспечивая там его размножение (клонирование) и образование конечного продукта гена (его экспрессию).

↑Принципы создания рекомбинантных молекул ДНК

.

Термин «Г. и.» получил распространение после того, как в 1972 П. Бергом с сотр. впервые была получена рекомбинантная ДНК, представлявшая собой гибрид, в котором были соединены фрагменты ДНК бактерии кишечной палочки, её вируса (бактериофага λ) и ДНК обезьяньего вируса SV40. В 1973 С. Коэн с сотр. использовали плазмиду pSC101 и рестриктазу (EcoRI), которая разрывает её в одном месте таким образом, что на концах двухцепочечной молекулы ДНК образуются короткие комплементарные одноцепочечные «хвосты» (обычно 4–6 нуклеотидов). Их назвали «липкими», поскольку они могут спариваться (как бы слипаться) друг с другом. Когда такую ДНК смешивали с фрагментами чужеродной ДНК, обработанной той же рестриктазой и имеющей такие же липкие концы, получались новые гибридные плазмиды, каждая из которых содержала по крайней мере один фрагмент чужеродной ДНК, встроенной в EcoRI-сайт плазмиды. Стало очевидным, что в такие плазмиды можно встраивать фрагменты разнообразных чужеродных ДНК, полученных как из микроорганизмов, так и из высших эукариот.

Основная современная стратегия получения рекДНК сводится к следующему:

1. в ДНК плазмиды или вируса, способных размножаться независимо от хромосомы, встраивают принадлежащие др. организму фрагменты ДНК, содержащие определ. гены или искусственно полученные последовательности нуклеотидов, представляющие интерес для исследователя;
2. образующиеся при этом гибридные молекулы вводят в чувствительные прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются (размножаются, амплифицируются) вместе со встроенными в них фрагментами ДНК;
3. отбирают клоны клеток в виде колоний на специальных питательных средах (или вирусов – в виде зон просветления – бляшек на слое сплошного роста клеток бактерий или культур тканей животных), содержащие нужные типы молекул рекДНК и подвергают их разностороннему структурно-функциональному изучению.

Для облегчения отбора клеток, в которых присутствует рекДНК, используют векторы, содержащие один и более маркеров. У плазмид, например, такими маркерами могут служить гены устойчивости к антибиотикам (отбор клеток, содержащих рекДНК, проводят по их способности расти в присутствии того или иного антибиотика). РекДНК, несущие нужные гены, отбирают и вводят в реципиентные клетки. С этого момента начинается молекулярное клонирование – получение копий рекДНК, а значит и копий целевых генов в её составе. Только при возможности разделения всех трансфицированных или инфицированных клеток каждый клон будет представлен отдельной колонией клеток и содержать определ. рекДНК. На заключительном этапе производится идентификация (поиск) клонов, в который заключён нужный ген. Она основывается на том, что вставка в рекДНК детерминирует какое-то уникальное свойство содержащей его клетки (напр., продукт экспрессии встроенного гена). В опытах по молекулярному клонированию соблюдаются 2 основных принципа:

• ни одна из клеток, где происходит клонирование рекДНК, не должна получить более одной плазмидной молекулы или вирусной частицы;
• последние должны быть способны к репликации.

В качестве векторных молекул в Г.и. используется широкий спектр плазмидных и вирусных ДНК. Наиболее популярны клонирующие векторы, содержащие несколько генетич. маркеров и имеющие по одному месту действия для разных рестриктаз. Таким требованием, напр., лучше всего отвечает плазмида pBR322, которая была сконструирована из исходно существующей в природе плазмиды с помощью методов, применяемых при работе с рекДНК; она содержит гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, содержит по одному сайту узнавания для 19 разных рестриктаз. Частным случаем клонирующих векторов являются экспрессирующие векторы, которые наряду с амплификацией обеспечивают правильную и эффективную экспрессию чужеродных генов в реципиентных клетках. В ряде случаев молекулярные векторы могут обеспечивать интеграцию чужеродной ДНК в геном клетки или вируса (их называют интегративными векторами).

Одна из важнейших задач Г.и. – создание штаммов бактерий или дрожжей, линий клеток тканей животных или растений, а также трансгенных растений и животных (см. Трансгенные организмы), которые обеспечивали бы эффективную экспрессию клонируемых в них генов. Высокий уровень продукции белков достигается в том случае, если гены клонируются в многокопийных векторах, т.к. при этом целевой ген будет находиться в клетке в большом количестве. Важно, чтобы кодирующая последовательность ДНК находилась под контролем промотора, который эффективно узнаётся РНК-полимеразой клетки, а образующаяся мРНК была бы относительно стабильной и эффективно транслировалась. Кроме того, чужеродный белок, синтезируемый в реципиентных клетках, не должен подвергаться быстрой деградации внутриклеточными протеазами. При создании трансгенных животных и растений часто добиваются тканеспецифичной экспрессии вводимых целевых генов.

Поскольку генетич. код универсален, возможность экспрессии гена определяется лишь наличием в его составе сигналов инициации и терминации транскрипции и трансляции, правильно узнаваемых хозяйской клеткой. Т.к. большинство генов высших эукариот имеет прерывистую экзон-интронную структуру, в результате транскрипции таких генов образуется матричная РНК–предшественник (пре-мРНК), из которой при последующем сплайсинге выщепляются некодирующие последовательности – интроны, и образуется зрелая мРНК. Такие гены не могут экспрессироваться в клетках бактерий, где отсутствует система сплайсинга. Для того чтобы преодолеть это препятствие на молекулах зрелой мРНК с помощью обратной транскриптазы синтезируют ДНК-копию (кДНК), к которой с помощью ДНК-полимеразы достраивается вторая цепь. Такие фрагменты ДНК, соответствующие кодирующей последовательности генов (уже не разделённой интронами), можно встраивать в подходящий молекулярный вектор.

Зная аминокислотную последовательность целевого полипептида, можно синтезировать кодирующую его нуклеотидную последовательность, получив т.н. ген-эквивалент, и встроить его в соответствующий экспрессирующий вектор. При создании гена-эквивалента обычно учитывают свойство вырожденности генетич. кода (20 аминокислот кодируются 61 кодоном) и частоту встречаемости кодонов для каждой аминокислоты в тех клетках, в которые планируется вводить этот ген, т.к. состав кодонов может существенно отличаться у разных организмов. Правильно подобранные кодоны могут значительно повысить продукцию целевого белка в реципиентной клетке.

↑Значение генетической инженерии

Г.и. значительно расширила экспериментальные границы молекулярной биологии, поскольку позволила вводить в разл. типы клеток чужеродную ДНК и исследовать её функции. Это позволило выявлять общебиологич. закономерности организации и выражения генетич. информации в разл. организмах. Данный подход открыл перспективы создания принципиально новых микробиологич. продуцентов биологически активных веществ. а также животных и растений, несущих функционально активные чужеродные гены. Мн. ранее недоступные биологически активные белки человека, в т.ч. интерфероны, интерлейкины, пептидные гормоны, факторы крови стали нарабатываться в больших количествах в клетках бактерий, дрожжей или млекопитающих, и широко использоваться в медицине. Более того, появилась возможность искусственно создавать гены, кодирующие химерные полипептиды, обладающие свойствами двух или более природных белков. Все это дало мощный импульс к развитию биотехнологии.

Глвными объектами Г.и. являются бактерии Escherichia coli (кишечная палочка) и Bacillus subtilis (сенная палочка), пекарские дрожжи Saccharomices cerevisiae, разл. линии клеток млекопитающих. Спектр объектов генно-инженерного воздействия постоянно расширяется. Интенсивно развиваются направления исследований по созданию трансгенных растений и животных. Методами Г.и. создаются новейшие поколения вакцин против различных инфекционных агентов (первая из них была создана на основе дрожжей, продуцирующих поверхностный белок вируса гепатита В человека). Большое внимание уделяется разработке клонирующих векторов на основе вирусов мле­копитающих и использованию их для создания живых поливалентных вакцин для нужд ветеринарии и медицины, а также в качестве молекулярных векторов для генной терапии раковых опухолей и наследственных заболеваний. Разработан метод прямого введения в организм человека и животных рекДНК, направляющих продукцию в их клетках антигенов разл. инфекционных агентов (ДНК-вакцинация). Новейшим направлением Г.и. является создание съедобных вакцин на основе трансгенных растений, таких как томаты, морковь, картофель, кукуруза, салат и др., продуцирующих иммуногенные белки возбудителей инфекций.

↑Опасения, связанные с проведением генно-инженерно экспериментов

Вскоре после первых успешных экспериментов по получению рекДНК группа учёных во главе с П. Бергом предложила ограничить проведение ряда генно-инженерных опытов. Эти опасения основывались на том, что свойства организмов, содержащих чужую генетич. информацию, трудно предсказать. Они могут приобрести нежелательные признаки, нарушить экологич. равновесие, привести к возникновению и распространению необычных заболеваний человека, животных, растений. Кроме того отмечалось, что вмешательство человека в генетич. аппарат живых организмов аморально и может вызвать нежелательные социальные и этические последствия. В 1975 эти проблемы обсуждались на междунар. конференции в Асиломаре (США). Её участники пришли к заключению о необходимости продолжения использования методов Г.и. но при обязательном соблюдении определ. правил и рекомендаций. Впоследствии эти правила, установленные в ряде стран, были существенно смягчены и свелись к приёмам обычным в микробиологич. исследованиях, созданию спец. защитных устройств, препятствующих распространению биологич. агентов в окружающей среде, использованию безопасных векторов и реципиентных клеток, не размножающихся в природных условиях.

Часто под Г.и. понимают только работу с рекДНК, а как синонимы Г.и. используются термины «Молекулярное клонирование», «Клонирование ДНК», «Клонирование генов». Однако все эти понятия отражают содержание лишь отдельных генно-инженерных операций и поэтому не эквивалентны термину Г.и. В России как синоним Г.и. широко используется термин «генная инженерия». Однако смысловое содержание этих терминов различно: Г.и. ставит целью создание организмов с новой генетич. программой, в то время как термин «генная инженерия» поясняет как это делается, т.е. путём манипуляции с генами.

↑Литература

Щелкунов С.Н. Клонирование генов. Новосибирск, 1986; Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК: Краткий курс. М., 1986; Клонирование ДНК. Методы М., 1988; Новое в клонировании ДНК: Методы М., 1989. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. 2-е изд., Новосибирск, 2004.