Зарегистрироваться

Химическая энзимология

Категории Химическая энзимология | Под редакцией сообщества: Химия

Эта версия статьи от 08 Февраль 2011 16:08, редактировал Ефременко Елена Николаевна
Список всех версий Перейти к списку версий
Перейти к последней версии

Химическая энзимология – это междисциплинарная область знаний, в рамках которой изучаются каталитические процессы, осуществляемые биологическими объектами – ферментами. Ферментативный катализ или биокатализ – ускорение химических реакций под действием ферментов. В основе функционирования различных живых объектов лежат многочисленные химические реакции расщепления питательных веществ, синтеза необходимых организмам химических соединений и трансформации их энергии в энергию разнообразных биохимических процессов (см. Рис. 1). Все эти реакции не могли бы происходить с необходимой для живых организмов скоростью, если бы в ходе эволюции не возникли механизмы их ускорения с помощью ферментативного катализа.

Химическая энзимология активно использует методы и подходы самых разных наук: химии, биологии и физики. Одновременно с этим химическая энзимология в свою очередь значительно обогащает новыми знаниями эти науки. Так, физическая химия и химическая кинетика являются основой изучения механизмов ферментативных реакций. Белок как макромолекула – предмет исследования полимерной химии и, в то же время,биохимии. Молекулярное моделирование предоставляет мощный, развитой аппарат для получения структур и изучения особенностей строения ферментов, а химическая энзимология в свою очередь даёт большую массу всевозможных объектов для исследований и дальнейшего развития этого аппарата. Использование ферментов для тонкого органического и энантиоселективного синтеза – вклад химической энзимологии в органическую химию. На основе ферментов созданы широко применяемые в настоящее время аналитические методы, такие как иммуноферментный анализ и различные методы, использующие биосенсоры в качестве чувствительных элементов. Очевидно, что мицеллярная энзимология представляет интерес, как для коллоидной химии, так и для ферментативного катализа. Явление биоэлектрокатализа объединяет энзимологию и электрохимию. Во многих областях современной науки и практики ферменты находят место либо как объект исследования, либо как инструмент для осуществления тех или иных процессов.

 

  

История открытия и исследования ферментов

Впервые каталитическое действие биоматериала было обнаружено Константином Сигизмундовичем Кирхгофом[1]. Он занимался проблемой получения сахара из крахмала. В 1811 году он представил в Академию наук образцы сахарного сиропа и кристаллического «сахара», полученные им путем гидролиза картофельного крахмала под действием разбавленной серной кислоты. Реакция протекала сутки, при этом серная кислота не расходовалась и по завершении процесса нейтрализовалась расчетным количеством карбоната кальция. Это был истинно каталитический процесс. В 1812 году К.С.Кирхгофом были изложены основы этого процесса в статье «О приготовлении сахара из крахмала».

Расширяя свои исследования, К.С. Кирхгоф обнаружил, что аналогичного результата можно добиться и без добавления кислоты, а под действием «клейковатого вещества» (клейковины), которую он получил из пшеничного зерна. 30 ноября 1814 года им был сделан доклад «О получении сахара при осолаживании злаков». Впервые было показано, что агентом, обеспечивающим гидролиз, является отличное от крахмала «клейковатое вещество».

Йёнс Якоб  Берцелиус был первым, кто осознал значимость влияния «третьего тела». Он использовал данные опытов К.С. Кирхгофа при построении своей концепции о катализе. В 1836 году Й. Я. Берцелиус написал: «В живых растениях и животных в тканях и жидкостях протекают тысячи каталитических процессов, осуществляя большое количество различных химических синтезов из общего исходного материала». Это была гениальная догадка.

В полном современном смысле понятие катализа вошло в химию, благодаря работам Вильгельма Оствальда(1853-1932), лишь спустя полвека после смерти Й. Я. Берцелиуса. В. Оствальд определил катализатор как вещество, «которое, не входя в конечный продукт химической реакции, увеличивает ее скорость». Он различал четыре типа катализаторов: контактное действие «зародышей», гомогенный катализ, гетерогенный катализ и действие ферментов. В 1902 г. В. Оствальду была присуждена Нобелевская премия по химии за работы по катализу и основополагающие исследования скоростей химических реакций.

Таким образом, основоположники теории изначально рассматривали ферментативный катализ как неотъемлемую составную часть катализа в целом.

Все великие химики первой половины 19-го столетия участвовали в дискуссии о природе каталитических процессов, проходящих в живых системах. В качестве модели и главного объекта анализа и дискуссии рассматривался процесс конверсии сахара в спирт или уксусную кислоту (винное или уксуснокислотное брожение).

Парижская Академия наук в 1799 году задала конкурсный вопрос: «Чем отличаются растительные и животные вещества, действующие как фермент [термин «фермент» (fermentum), «ферментация» (fermentation), вероятно, происходят от латинских слов fervere – вскипать, или ferveo – пениться и отражают наблюдаемый процесс пенообразования при спиртовом брожении, термины уходят своими корнями в алхимию], от тех веществ, которые подвергаются ферментации». Достаточно обоснованный ответ на этот вопрос был дан французским исследователем Шарлем Каньяр де ла Туром (1777-1859 гг.). Он экспериментально показал, что дрожжи, осуществляющие ферментацию – не просто химические вещества, а живые организмы, способные расти и размножаться, причём исходные вещества и продукты реакции – простые химические соединения. Этот вывод был встречен в штыки Й. Я. Берцелиусом, Ю. Либихом и Ф. Вёлером.

Й. Я. Берцелиус, Ю. Либих и Ф. Вёлер представляли себе процесс брожения как истинный химический процесс, в котором осадки в виде дрожжей обладают некоторой химической активностью. Фактически вопрос сводится к тому, что же представляет собой катализатор: химическое вещество неизвестной, возможно очень сложной, структуры или живой микроорганизм? Ю. Либих, Й. Я. Берцелиус, Ф. Вёлер и многие другие химики не могли воспринять идею о том, что живые организмы при брожении осуществляют химическую реакцию, несмотря на то, что поток фактов, подтверждающих это, непрерывно рос.

Бурная дискуссия по этому вопросу развернулась между Л. Пастером, Ю. Либихом и М. Бертло. Л. Пастер был ярым сторонником того, что брожение (то есть конверсию сахара в спирт или в уксусную кислоту и сопутствующие продукты) могут осуществить лишь живые клетки микроорганизмов. Л. Пастером была отвергнута сама идея о необходимости существования растворимых ферментов, участвующих в брожении. Он писал: «Я не вижу никакой необходимости в существовании этих ферментов, ни в полезности их функционирования при брожении». С другой стороны, Ю. Либих, проводя различные химические реакции с органическими молекулами, не мог допустить того, что для реализации такого простого химического процесса, как окисление спирта в уксусную кислоту (реакция идет под действием различных химических окислителей), необходимо участие такого сложного агрегата, как целая клетка живого микроорганизма [в конечном счёте Либих оказался прав: известно, что конверсию этанола в уксусную кислоту осуществляют два фермента – алкогольдегидрогеназа и ацетальдегидрогеназа]. Ю. Либих предполагал, что наблюдается всего лишь корреляция между «физиологическим процессом» образования продуктов и ростом клеток.

Значительную роль в прояснении вопроса сыграла дискуссия между Луи Пастером и Марселином Бертло. М. Бертло полагал, что процесс брожения осуществляется органической субстанцией дрожжей. Важным был эксперимент М. Бертло, в котором он разрушил клетки дрожжей, получил бесклеточный экстракт, переосадил его спиртом без существенной потери активности и показал, что полученная субстанция обладает каталитическими свойствами. Этот эксперимент показал, что«фермент» и живые клетки микроорганизмов не одно и то же: клетки содержат вещества, реально осуществляющие брожение.

На то, что брожение имеет характер каталитического процесса, указывал Э. Митчерлих(1794-1863 гг.). В 1843 году он отмечал, что для проведения процесса сбраживания сахара необходимы относительно ничтожные количества дрожжей, не соизмеримые с количеством конвертированного субстрата (менее одного процента), то есть вклад вещества дрожжей в материальный баланс реакции ничтожен.

Существенную роль в дискуссии сыграла неоднозначность в терминах, существовавшая в те годы. В течение многих лет дрожжи называли ферментом. Л. Пастер был против распространения термина «фермент» на растворимые вещества, способные проводить конверсию сахара, а понимал под «ферментом» живые растущие клетки, осуществляющие образование этиленового спирта и СО2. Термин «энзим» и энзимология был введен в 1876 году В. Кюном для обозначения «неорганизованных», «бесформенных» ферментов, таких, как диастаза, пепсин, трипсин, известных уже тогда.

Точку в этом историческом споре поставили опыты Э.Бухнера (1897 г.), которые продемонстрировали возможность проведения процесса брожения под действием бесклеточных экстрактов. Э. Бухнер тщательно механически разрушал клетки дрожжей, наблюдая за процессом под микроскопом, проводил экстракцию водой с отделением жидкости от твердых частиц фильтрованием под высоким давлением. Полученный раствор смеси ферментов был способен к интенсивному выделению спирта и СО2 при введении его в раствор сахарозы. На реакцию не действовали классические антисептики. Опыты показали, что брожение – результат действия ферментов, не зависящей от целостности клетки. В 1907 году Э. Бухнеру была присуждена Нобелевская премия по химии.

Результатом работы большой группы исследователей 19-го века, начиная с К.С. Кирхгофа, Й.Я. Берцелиуса, заканчивая В.Оствальдом и Э.Бухнером, явилось утверждение, что ферменты – это химические катализаторы и необходимо искать объяснения действия ферментов на химической основе.

Итак, стало ясно следующее:

– Химический катализ и биологический катализ - суть явления одного порядка, катализаторы обладают общим свойством – ускорения химических реакций «третьим телом». При этом существуют как общие катализаторы, способные ускорять многие реакции, такие как кислоты, так и специфические катализаторы, хорошо «работающие» для узкого круга реакций и ограниченного набора субстратов. Последнее свойство характерно для ферментов.

– В клетках микроорганизмов, растений, животных, человека имеются вещества, обладающие исключительно высокой каталитической активностью.

– Биологические катализаторы способны проводить как простейшие химические реакции (инверсию сахара, гидролиз белков, реакции окисления), так и сложные процессы, такие, как диспропорционирование сахара в этанол и СО2.

Значительным результатом была демонстрация факта, что биокаталитической функцией обладают белки. Наиболее четко это было сформулировано немецким исследователем Маркусом Траубе. В 1858 году, он в рамках своего представления о действии ферментов, характеризовал ферменты как химические вещества белковой природы.

Этому предшествовал этап накопления отдельных экспериментальных фактов. В 1830 году П. Робике и А. Бутрон-Шаляр исследовали гидролиз аминдалина под действием измельченного горького миндаля. В 1831 году Э. Лейксом было обнаружено, что слюна обладает активностью диастазы. Впервые достаточно очищенный препарат фермента был получен А. Пайеном и Ж. Персом в 1833 году. Они выделили амилазу из солода, осадив ферментный препарат спиртом. Аналогичными методами удалось получить ферментный препарат синигриназы (Ж. Форс, 1835 г.), пепсина (Т. Шванн, 1836 г.), трипсина (А. Корвизар, 1857 г.). Заметную роль в развитии методологии выделения ферментов сыграли работы Э. Брюкке и А.Я. Данилевского, в которых использовано явление адсорбции для разделения белков. В 1862 г. Данилевскому впервые удалось разделить трипсин и панкреатическую амилазу. Эти работы заложили основы современных методов получения белков.

Следующий этап исследования ферментов связан с выявлением, осознанием и анализом того факта, что ферменты обладают способностью взаимодействовать лишь с избранными субстратами, то есть обладают специфичностью, а также доказательствами того, что субстрат в процессе каталитической реакции образует лабильный комплекс с белком.

Детальное исследование ряда каталитических систем провел Эмиль Фишер (1852-1919 гг.). Он синтетически получил дипептиды и олигопептиды. В 1907 г. им был синтезирован октадекапептид, состоящий из восемнадцати различных аминокислот. В 1894 году Э. Фишер начал цикл работ по специфичности действия ферментов. Эти работы были следствием его исследований структуры сахаров и пептидов. Для объяснения специфичности действия ферментов им было сформулировано положение о том, что субстрат подходит к ферменту как ключ к замку. Это положение не потеряло актуальности и сегодня, оно лежит в основе представлений о стерическом соответствии между субстратом и ферментом. Выдающиеся работы были выполнены Э. Фишером в области химии углеводов и красителей. Работы Э. Фишера заложили основы изучения нуклеиновых кислот. За исследования сахаров и пуриновых производных в 1902 г. Э. Фишер был удостоен Нобелевской премии по химии.

То, что фермент взаимодействует с субстратом и образует «фермент-субстратный комплекс», следовало из анализа кинетики каталитической реакции. Впервые скорость ферментативных реакций проанализировал Г. Тамман<. Он провел тщательное сравнительное исследование действия ферментов и химических катализаторов гидролиза и показал, что ферментативный гидролиз гликозидов и дисахаридов аналогичен классическому кислотному, исследуемому со времен К.С. Кирхгофа. Г. Тамман впервые изучил температурные зависимости скорости ферментативной реакции. Результаты работы были опубликованы в 1892 году в «Журнале Русского физико-химического общества» и впоследствии в «Журнале физической химии», издаваемом Я. Вант-Гоффом и В. Оствальдом.

Достаточно завершенную форму химико-кинетические исследования приобрели в работах В. Анрии Л. Михаэлиса. Из кинетических данных однозначно следовало, что в процессе каталитического действия фермент образует комплекс с субстратом. Интерпретация В. Анри и Л. Михаэлиса роли этого комплекса была различной, однако оба подхода для объяснения экспериментальных данных постулировали образование фермент-субстратного комплекса.

Значительный вклад в фундамент химической кинетики ферментативного катализа внесли работы Э.Армстронга (1904 г.), обнаружившего эффекты ингибирования ферментативных реакций аналогами субстрата, и С. Соренсена (1868-1939 гг.), продемонстрировавшего зависимость скоростей ферментативных реакций от концентрации ионов водорода.

Таким образом, практически все великие химики 19-го столетия внесли свой вклад в создание фундамента химической энзимологии. Их притягивал феномен биологического катализа. Работая в совершенно различных областях химии (общая и неорганическая химия, органическая химия, физическая химия), каждый из них сформировал своё понимание этой загадки природы. Общий, междисциплинарный характер химической энзимологии сохраняется и сегодня.

XX-ый век внес в понимание феномена биологического катализа очень многое. Качественно изменили облик химической энзимологии новые физико-химические методы исследования. Методы молекулярной биологии и генетической инженерии многое прояснили в механизмах реакций и позволили получать биокатализаторы новой структуры, не существующие в природе. В XX-ом веке в науку пришло много исследователей, что способствовало резкому количественному и качественному подъёму знаний. Наконец, появились методы работы с большими объемами информации и проведения вычислений гигантских объемов. Как многие отрасли химии, химическая энзимология стала разделом технической химии.

Нельзя сегодня утверждать, что феномен биологического катализа понят до конца. Основной вопрос, оставшийся неразгаданным – это каким образом возникли биологические катализаторы, обладающие фантастической активностью, как они эволюционируют, не ясны детали многих ферментативных реакций, не до конца прояснены механизмы регуляции активности ферментов и механизмы регуляции их экспрессии, не всегда однозначно прослеживается связь каталитических активностей фермента с физиологическими ответами клетки.

 

Химическая энзимология в современной химии

Ферментный катализ значительно отличается от обычного катализа с традиционными химическими катализаторами. По сравнению со свободно протекающими реакциями или с простыми химическими катализаторами, такими, как кислоты, увеличение скорости процессов под действием ферментов достигает миллионов и миллиардов раз (как в случае уреазы или миозина).

В настоящее время известно более 3700 ферментов, различающихся по реакциям, которые они катализируют. В 1961 году Международный союз по биохимии и молекулярной биологии принял схему классификации и номенклатуры ферментов, которая является общепринятой в настоящее время [2]. В основу классификации положена химическая реакция, которую катализирует тот или иной фермент. Все известные ферменты были рассортированы на шесть основных классов: 1 – оксидазы, 2 – трансферазы, 3 – гидролазы, 4 – лиазы, 5 – изомеразы, 6 – лигазы или синтетазы. Номенклатура фермента складывается из нумерации класса, подкласса, подподкласса. Таким образом, первое число показывает, к какому классу из шести вышеперечисленных относится данный фермент. Второе число характеризует природу субстрата реакции. Третье и четвёртое число дают дополнительную информацию о химической реакции, в которой участвует фермент. Например, карбоксилэстераза (гидролаза эфиров карбоновых кислот) обозначается 3.1.1.1.

Ферменты, по сути являясь каталитически активными белками, состоят в основном из 20 «канонических» a-L-аминокислот, соединённых пептидными связями, которые возникают в результате взаимодействия a-аминогруппы (‑NH2) одной аминокислоты с a-карбоксильной группой (‑СООН) другой, поэтому белки также называются пептидами или полипептидами (Рис. 2).

 

В результате кето-енольной таутомерии пептидная связь является частично сопряжённой, и четыре атома лежат в одной плоскости. При этом более стабильной оказывается транс-форма. Гидролиз пептидной связи является экзогенным, но в физиологических условиях протекает крайне медленно за счёт высокого активационного барьера. Так, среднее время полуразложения в таких условиях составляет примерно 7 лет. Значительное ускорение гидролиза пептидных связей, например, в инактивированных ферментах или белках, потребляемых с пищей, достигается за счёт использования различных протеолитических ферментов.

Из 20 аминокислот 8 являются незаменимыми, они не синтезируются в организме человека и обязательно должны поступать с пищей: триптофан, фенилаланин, лизин, треонин, метионин, лейцин, изолейцин и валин. Остальные 12 могут быть получены в результате анаболизма: тирозин, цистеин, гистидин, аргинин, глицин, аланин, серин, глутамат, глутамин, аспартат, аспарагин, пролин. Помимо указанных L-аминокислот в состав белков крайне редко могут входить D-аминокислоты (например, в маленьких пептидах, входящих в состав бактериальной клеточной стенки, выполняющих функции нейромедиаторов или проявляющих антимикробную активность), а также неканонические аминокислоты, получаемые в результате модификации L-аминокислот: 4-гидроксипролин, 5-гидроксилизин, 6-N-метиллизин, γ-карбоксиглутаминовая кислота, десмозин и Se-цистеин.

Различают четыре уровня структурной организации белковых молекул: первичную, вторичную, третичную и четвертичную.

Первичная структура – аминокислотная последовательность пептидной цепи белка, формирующаяся в процессе считывания генетической информации с ДНК в результате процессов трансляции и транскрипции. Данная последовательность однозначно определяет строение белка на более высоких уровнях и его свойства. Различают консервативные участки, остающиеся практически неизменными в процессе эволюции видов и определяющие класс синтезируемого белка, и лабильные (полиморфные), изменение которых в результате различного рода мутаций приводит к модификации белка, оказывая положительное либо отрицательное влияние на его свойства и функции. Первичная структура может быть определена в результате секвенирования. В настоящее время для этого используют либо полученную ранее нуклеотидную последовательность ДНК, кодирующую биосинтез данного белка и определяющую его аминокислотную последовательность, либо методику частичного или полного протеолиза с последующим определением образующихся аминокислот или небольших олигопептидов методами хроматографии, масс-спектрометрии и др.

Вторичная структура, формирующаяся в процессе сворачивания (фолдинга) белковой молекулы, состоит из неупорядоченных и упорядоченных участков полипептидной цепи. Стабилизация той или иной структуры достигается за счёт гидрофобных, электростатических и водородных взаимодействий. Одним из основных упорядоченных элементов вторичной структуры, который образован примерно четвертью всех аминокислот, считаются a-спирали, представляющие собой плотные витки полипептидной цепи с шагом 0,54 нм, закрученные вокруг одной оси вправо, содержащие 3,6 аминокислотных остатка на один виток и стабилизированные водородными связями. Дестабилизация a-спиралей может происходить в результате возникновения других взаимодействий между аминокислотными остатками: электростатического отталкивания или притягивания, отталкивания или стерического затруднения свободного вращения объёмных радикалов соседних аминокислотных остатков, чрезмерной гибкости цепи за счёт наличия глицина или, напротив, излишней жесткости за счёт присутствия пролина, и, наконец, возникновения наведённого диполя между концевыми группами. Другими структурированными элементами белков являются b-складки и b- листы, состоящие из цепей, связанных несколькими водородными связями между собой, и лежащие в одной плоскости. b-структуры могут быть параллельными или антипараллельными в зависимости от того, со-направлены или противоположно направлены оптические оси аминокислотных последовательностей, лежащих вблизи.

Третичная структура формируется в результате взаимодействия между собой элементов вторичной структуры и неструктурированных фрагментов полипептидной цепи. Стабилизация такой структуры осуществляется за счёт гидрофобных взаимодействий, образования водородных или ковалентных связей (дисульфидных мостиков) и ионных взаимодействий между противоположно заряженными частями молекулы белка. Зачастую в результате таких взаимодействий осуществляется пространственное сближение аминокислотных остатков значительно удалённых друг от друга в полипептидной цепи. Именно за счёт третичной структуры белки, а в том числе и ферменты получают возможность выполнять свои функции. Третичные и вторичные структуры белков могут быть определены с использованием рентгеноструктурного анализа. Ограничением данного метода является использование для анализа кристаллов белков, что ассоциировано с рядом сложностей, вызванных трудностью получения кристаллических форм некоторых белков. Кроме того, строение белков в кристаллах или замороженном состоянии может существенно отличаться от того, в каком виде они находятся в растворе. В последнее время со значительным развитием мощности вычислительной техники, а также с накоплением большой базы структур белков, полученных рентгеновским методом анализа, огромный прогресс наблюдается в методах математического моделирования белков. В результате этого происходит экспоненциальный рост количества рассчитанных структур, что позволяет вывести химическую энзимологию на новый уровень.

Четвертичная структура образуется в результате взаимодействия нескольких белков, обладающих собственной третичной структурой, с возникновением единого многосубъединичного комплекса. Подобные комплексы могут содержать как одинаковые субъединицы с образованием димеров, тримеров и прочих олигомеров, так и разные, обладающие различным строением и свойствами. Наиболее ярким примером образования подобного рода структур является АТФ-синтазный комплекс, состоящий из более чем 30 субъединиц .

Ключевое понятие в ферментативном катализе – «активный центр», под которым понимается совокупность радикалов аминокислот, осуществляющих сорбцию субстрата, его химическую активацию и трансформацию. Условно активный центр можно разделить на сорбционный и каталитический подцентры (участки), выполняющие свои собственные функции.

Одним из фундаментальных представлений о механизмах ферментативной реакции является представление о фермент-субстратном комплексе, образующемся на пути трансформации субстрата в продукт под действием фермента. Считается, что механизмы ферментативных реакций выглядят следующим образом: субстрат образует комплекс с активным центром фермента, в комплексе происходят фермент-субстратные изменения, образуются продукты реакции, которые уходят из активного центра, освобождая его для взаимодействия с новой молекулой субстрата.

Зависимость начальной стационарной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата в условиях избытка субстрата описывается гиперболической функцией, называемой уравнением Михаэлиса-Ментен (см. Рис. 3):

 

 

 

при этом параметр Vm линейно увеличивается с ростом количества фермента, вводимого в реакцию:

 

где E0 – начальная концентрация фермента.

Для характеристики ферментативных реакций обычно определяют оба параметра, входящие в уравнение Михаэлиса – Ментен: максимальную скорость Vm и константу Михаэлиса Km. Исторически сложилось два метода линеаризации уравнения Михаэлиса, дающих наименьшую ошибку определения:

1. Метод двойных обратных координат

 

2. Метод Скэтчарда (Иди-Хофсти)

 

С развитием и широким распространением вычислительной техники и программного обеспечения стало возможным прямое определение данных величин путём гиперболической аппроксимации экспериментальных данных.

На ферментативную активность оказывают влияние не только концентрация фермента или субстрата, но и множество других факторов, таких как: наличие ингибиторов или активаторов, температура, рН среды, ионная сила раствора и др.

Влияние температуры на равновесные стадии ферментативной реакции не отличается от других химических реакций. В то же время, для скоростей ферментативных реакций характерно наличие «температурного оптиума» – диапазона температур, при которых скорость ферментативных реакций максимальна. Уменьшение температуры приводит к уменьшению скорости химической реакции за счет уменьшения доли молекул фермента и субстрата с высокой энергией, что соответствует обычной химической кинетике. Так как ферменты являются белковыми молекулами, увеличение температуры приводит к их «плавлению», а затем и денатурации. Поэтому повышение температуры выше определенных значений обычно вызывает уменьшение скорости ферментативной реакции. Существует ряд способов увеличения стабильности ферментов к инактивирующему действию высоких температур.

Исторически, первым способом стабилизации ферментов стала их иммобилизация на поверхности или в матрице различных носителей. Стабилизация при иммобилизации достигается за счёт фиксации структуры молекулы ферментов, в результате чего затрудняется процесс их плавления и последующей денатурации. Большую роль в развитии данного направления в России сыграли работы член-корреспондента АН СССР Ильи Васильевича Березина[3]. В качестве носителей для иммобилизации могут быть использованы носители как неорганической, так и органической природы. Кроме того, носители могут быть классифицированы как синтетические и природные. Объектами иммобилизации могут быть очищенные или неочищенные ферменты, а также комплексы (ансамбли) ферментов. Иммобилизация может осуществляться за счет ковалентного (химического) связывания белка с носителем, а также за счет физического включения на поверхности или в матрице носителя. Были разработаны и успешно внедрены более совершенные методы, среди которых: – аффинное связывание, проводимое за счет специфичных взаимодействий (антиген-антитело, гормон-рецептор и т.д.); – металл-хелатирующее связывание, использующее взаимодействие ионов двухвалентных металлов, которыми заряжен носитель, с природными или генетически введенными аминокислотными последовательностями в молекуле белка (полигистидиновой, полиаргининовой и т.д.); – ионное связывание, которое основано на взаимодействии ионообменных носителей с ионогенными группами на поверхности молекулы белка; и др. В целом иммобилизация ферментов копирует существующие в природе системы, в которых зачастую ферментативный катализ осуществляется ферментами, фиксированными, например, в клеточной стенке или в многосубъединичных комплексах. Иммобилизация ферментов настолько их стабилизирует, что во многих случаях позволяет многократно использовать такие биокатализаторы, что вызывает огромный интерес к системам подобного рода со стороны промышленности. Работы, начатые И.В. Березиным и связанные с иммобилизацией не только одиночных ферментов, но и их ансамблей, а также целых клеток продолжаются на кафедре химической энзимологии в лаборатории «Постгеномной химии» (руководитель – И.Н. Курочкин), «Биомедицинского применения белков и ферментов, фарма- биотехнологии» (руководитель – Н.И. Ларионова) и «Экобиокатализа» (руководитель – Е.Н. Ефременко).

Второй способ стабилизации основан на использовании мицелл. Мицеллярная энзимология – научное направление, заложенное пионерскими работами, выполненными в Московском университете Карлом Мартинеком и И.В.Березиным [4]. Включение ферментов в агрегаты (мицеллы) поверхностно-активных веществ различной структуры, формы и размеров, как и иммобилизация, приводит к увеличению термодинамической стабильности структуры молекул белков за счет снижения их подвижности. Одновременно с этим каталитическая активность ферментов в таких системах возрастает, во многих случаях существенно превышая уровень, наблюдаемый в водных растворах. Работы в данной области активно продолжаются учениками К. Мартинека и И.В. Березина на кафедре химической энзимологии в лаборатории «Мицеллярной энзимологии» (руководитель – А.В. Левашов) и «Химический дизайн бионаноматериалов» (руководитель – Н.Л. Клячко).

Третий способ стабилизации ферментов стал доступен с развитием методов молекулярной инженерии, молекулярной биологии и математического моделирования структуры белков. Он заключается в изменении первичной (аминокислотной) последовательности с целью замены одних аминокислот на другие, которые приводят к стабилизации структуры за счёт дополнительно создаваемых в белке нековалентных гидрофобных связей, солевых мостиков или ковалентных S-S связей. Стабильность ферментов также может быть увеличена введением в его структуру специального термостабилизующего домена, обнаруженного у некоторых термофильных бактерий, или введением неприродных модифицированных аминокислот (например, фторсодержащих) [5]. Данные методы активно совершенствуются на кафедре химической энзимологии в лаборатории инженерной энзимологии (руководитель – А.М.  Егоров), а также в выделившихся из данной лаборатории группах «Генетической инженерии и белкового дизайна» (руководитель – В.И. Тишков) и «Иммунохимических методов анализа» (руководитель – С.А. Еремин).

Влияние рН среды обусловлено тем, что все известные ферменты содержат ионогенные группы, которые зачастую входят в состав их активных центров. Вследствие этого протонирование или депротонирование таких групп могут приводить к изменению каталитической активности. Для рН-зависимостей активности ферментов, как и для температурных зависимостей, характерно наличие рН-оптимума. Анализ зависимости активности фермента от рН позволяет судить о том, какие именно аминокислоты, входящие в активный центр, важны для катализа. Именно таким образом на заре развития ферментативного катализа в отсутствие данных рентгеноструктурного анализа высокого разрешения и молекулярного моделирования были установлены механизмы действия многих важных ферментов. В настоящее время информация о зависимости активности от рН среды носит скорее прикладной характер, а именно, как информация об операционных характеристиках ферментативных каталитических систем.

Исследования поведения ферментов на границе раздела фаз «электронный проводник – ионный проводник» («электрод – раствор электролита») было обнаружено явление, названное биоэлектрокатализом и основанное на свойстве ферментов ускорять электрохимические реакции при организации «электрического контакта» между проводником и активным центром фермента. «Электрический контакт» такого рода предполагает организацию быстрого и эффективного электронного транспорта между проводником и активным центром. Оказалось, что некоторые окислительно-восстановительные ферменты способны значительно увеличивать скорость электрохимических реакций после адсорбции (или хемосорбции) их на поверхности проводника. Явление биоэлектрокатализа позволило вовлечь в исследование ферментативных реакций экспериментальные и теоретические методы современной электрохимии. Стоит отметить, что к классу окислительно-восстановительных ферментов, которые могут быть изучены таким образом, относятся многие жизненно необходимые ферменты, например: ферменты электрон-транспортной цепи, расположенные в митохондриях эукариот или цитоплазматической мембране прокариот и, в конечном счете, позволяющие запасать энергию окисления углеродсодержащих веществ в молекулах АТФ; ферменты, участвующие в фотосинтезе; и т.д. По существу, процессы переноса электрона при температурах, близких к комнатным, представляют собой обычные химические реакции. Эти реакции ускоряются с возрастанием температуры в соответствии с уравнением Аррениуса и характеризуются заметными положительными значениями энергии активации. В реальных условиях функционирования электронно-транспортных цепей в биологических системах перенос электрона связан с преодолением электроном существенного энергетического барьера. Частоты переноса электронов между белковыми переносчиками лежат в диапазоне 102–107 сек–1. Из экспериментальных данных по электронному транспорту в нестационарных режимах могут быть найдены константы скорости всех элементарных стадий переноса электрона. Этот подход последовательно и плодотворно применялся для исследования процесса переноса электрона в митохондриальной дыхательной цепи. Первооткрыватели явления биоэлектрокатализа, И.В. Березин, Сергей Дмитриевич Варфоломеев и Александр Иванович Ярополов, большое внимание уделяли и другим окислительно-восстановительным ферментам – люциферазам. Далее работы получили свое развитие на кафедре химической энзимологии в лаборатории «Физико-химических основ биоконверсии энергии» (руководитель – Н.Н. Угарова) и «Биосенсоров и электроанализа» (руководитель – А.А. Карякин).

Механизмы ферментативных реакций представляют собой достаточно сложные цепи перестройки исходных субстратов в конечные продукты с участием большого числа относительно короткоживущих промежуточных соединений. Кинетический анализ механизма той или иной реакции приводит к кинетической схеме, составленной из элементарных стадий, часть из которых протекают так быстро, что в микросекундные интервалы времени устанавливается равновесие между компонентами процесса, а часть – имеют характеристические времена в миллисекундном диапазоне, являясь лимитирующими стадиями. Подобные стадии, определяющие скорость процесса в целом, связаны с большими конформационными изменениями в молекуле фермента. За счёт подобных конформационных изменений в исходном состоянии обеспечивается структура, близкая к состоянию переходного комплекса или продукта реакции, тем самым уменьшается потенциальный барьер реакции. Большой цикл работ по установлению механизмов действия ферментов был осуществлен на кафедре химической энзимологии, в частности, в группах: «Биомедицинское применение белков и ферментов. фарма-биотехнология» (руководитель – Н.И. Ларионова), «Пептидазы: механизм действия и физиологическая активность» (руководитель – О.А. Кост) и «Биохимии фибринолиза» (руководитель – Р.Б. Айсина). Отдельно стоит отметить работы Лаборатории физико-химии ферментативной трансформации полимеров (руководитель – А.П. Синицын), которые позволили перейти к практической реализации процесса ферментативного гидролиза различного целлюлозосодержащего сырья.

Сегодня химическая энзимология является в высокой степени зрелой областью науки. Развитие знаний в этой области позволило расширить фундаментальное понимание не только химических, но и биологических процессов в живой природе. Области современного использования ферментов достаточно разнообразны: химический синтез сложных органических молекул, химический анализ, электрокатализ, фармацевтическая индустрия, пищевая промышленность, бытовая химия, сельское хозяйство, защита окружающей среды. Можно ожидать, что роль химической и инженерной энзимологии в будущем будет только возрастать.

 

Рекомендуемая литература

Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной химии

Березин И.В. Биотехнология Т.7. Иммобилизованные ферменты

Березин И.В. Биотехнология Т.8. Инженерная энзимология

Варфоломеев С.Д. Химическая энзимология

Диксон М., Уэбб Э. Ферменты

Дженкс В. Катализ в химии и энзимологии

Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика

Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики

Кнорре Д.Г., Крылова Л.Ф., Музыкантов В.С. Физическая химия

Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия

Ленинджер А. Основы биохимии

Синицын А.П., Гусаков А.В., Черноглазов В.М. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов

 

 

 

 

1. Варфоломеев С.Д. (2005) Химическая энзимология. М.: Академия, 480 с.

2. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/

3. Березин И.В., Клячко Н.Л., Левашов А.В., Мартинек К., Можаев В.В., Хмельницкий Ю.Л. (1987) Биотехнология. Т.7. Иммобилизованные ферменты. М.: Высшая школа, 157 с.

4. Martinek K., Levashov A.V., Klyachko N.L., Khmelnitsky Yu.L., Berezin I.V. (1986) Micellar enzymology. Eur. J. Biochem., v.155(3), p.453-468.

Эта статья еще не написана, но вы можете сделать это.