Генетика микроорганизмов

В клетке прокариот наследственный материал чаще всего представлен кольцевой молекулой ДНК (кольцевой хромосомой), которая в зависимости от условий может присутствовать в виде одной или нескольких копий. ДНК содержится также во внехромосомных генетических элементах – плазмидах, в большинстве случаев являющихся кольцевыми, автономно реплицирующимися небольшими молекулами. Совокупность всех генов организма называют генотипом, а совокупность присущих организму признаков – фенотипом. При изменении внешних условий большинство клеток в популяции претерпевает изменения, имеющие приспособительный характер (адаптационная изменчивость). Адаптации не наследуются, так как они не затрагивают генотип и вызваны регуляцией клеточного метаболизма. Скачкообразные изменения генотипа носят название мутаций. Спонтанными называют мутации, вызванные неизвестными факторами, а индуцированные происходят под влиянием определенных факторов, называемых мутагенами. Изменение одного нуклеотидного остатка (замена, вставка или выпадение) называют точечной мутацией. Мутации, ведущие к существенным нарушениям последовательности и количества генов, затрагивают бόльшие участки ДНК.

Защиту генетического материала от повреждающего действия мутагенов независимо от их природы осуществляют репарационные системы (фотореактивация и темновая репарация).

Для проявления мутации необходимо, чтобы изменение закрепилось в дочерней молекуле ДНК, т.е. должна произойти репликация. Для фенотипического проявления мутации требуется прохождение транскрипции и трансляции. Так как микроорганизмы существуют не в виде отдельных особей, а в виде популяций, то, как правило, нужно несколько клеточных делений, чтобы новый признак проявился. Если клетка имеет несколько копий хромосомы, то мутация также проявится в фенотипе клеток только через несколько клеточных делений.

↑Обмен генетической информацией у прокариот

Наследственную изменчивость у прокариотических микроорганизмов вызывают рекомбинации генетического материала трех основных типов: конъюгация, трансформация и трансдукция.

Конъюгация предполагает непосредственный контакт клетки-донора и клетки-реципиента. Клетка-донор должна обладать половой плазмидой (F-фактором), который может быть автономен или интегрирован в хромосому. F-фактор обуславливает способность донорной клетки вступать в контакт с реципиентом, формировать половые F-пили и передавать генетический материал. При автономной локализации F-фактора клетка-донор передает клетке-реципиенту его копию, при этом реципиентная клетка приобретает способность вступать в конъюгацию уже в качестве донора. В случае интеграции F-фактора в хромосому донора (штамм Hfr) передача наследственного материала осуществляется с высокой частотой. Перенос генетического материала строго ориентирован: разрыв копии хромосомы и передача ДНК происходит в локусе 0 в пределах полового фактора. Скорость переноса в одинаковых условиях для определенного штамма является постоянной. Поскольку контакт клеток очень нестабилен и часто прерывается, то переход всей копии хромосомы в клетку-реципиент – явление редкое. Перешедший в клетку генетический материал может встраиваться в хромосому клетки-реципиента при наличии гомологичных участков. Так как первым реципиенту передается всегда один и тот же, специфичный для каждого штамма, участок хромосомы, то частота передачи стоящих следом за ним генов позволяет расположить их по отношению к этому локусу и составить генетическую карту хромосомы.

В процессе трансформации участвуют клетка-реципиент и растворенная ДНК, выделенная из другого микроорганизма. Двухцепочечные фрагменты ДНК должны обладать значительной молекулярной массой, а клетка-реципиент - находиться в определенном физиологическом состоянии (компетентности), чтобы поглотить «чужую» ДНК. При наличии определенной гомологии проникший фрагмент может включиться в хромосому реципиента.

При трансдукции функцию переносчиков генетического материала (векторов) выполняют фаги, случайно захватывающие фрагмент хромосомы хозяина при образовании зрелых фаговых частиц. Заражая клетку-реципиент и интегрируя свою ДНК в хромосому нового хозяина, такой фаг включает одновременно в хромосому и фрагмент ДНК первого хозяина. Чтобы новый признак мог проявиться в клетке-реципиенте необходимо длительное пребывание фага в латентном состоянии.

Перенос генетического материала из клетки в клетку осуществляется также путем передачи плазмид.

↑Процесс диссоциации у бактерий

Диссоциацией называют появление колоний разной морфологии при рассеве чистой культуры на твердую среду. Механизм этого явления еще не раскрыт полностью, однако в практике научных исследований с ним сталкивается практически каждый, кто работает с микроорганизмами. Он имеет постоянный характер и более высокую частоту (~10^-4), чем спонтанные мутации. Наиболее часто образуются три морфотипа колоний: R - шероховатые, S - гладкие и M - слизистые. У ряда микроорганизмов были обнаружены колонии одного морфотипа, но имеющие незначительные модификации (например, гладкие, но существенно различающиеся по блеску, и тогда обозначаемые как S₁). Первоначально это явление, названное «вариацией фаз», было отмечено у патогенных микроорганизмов – Salmonella, Shigella, E. coli. В разных фазах протекания болезни наблюдали преобладание определенного типа колоний (S - в эпидемической фазе, R - в постэпидемической).

Различия в виде колоний обычно выявляются не на любой плотной среде, а только на среде, богатой углеводами. Колонии разных морфотипов различаются по диаметру, но содержат одинаковое количество по-разному упакованных клеток. Как правило, M- и R-колонии по диаметру в 2 раза больше, чем колонии S-варианта. В то же время каждая колония уже содержит клетки всех трех типов. Плотная или рыхлая «упаковка» клеток в колонии зависит прежде всего от способа расхождения делящихся клеток (образуются либо цепочки клеток, лежащие на прямой, как у R-форм, либо расположенные под углом одна к другой V-образные формы, как у S- и M-вариантов). Особенности расхождения клеток диссоциантов при делении обуславливаются различиями химического состава и электрозаряженности вещества капсул (при отрицательных зарядах возникает отталкивание оболочек). Различия в клеточных оболочках (капсула+ клеточная стенка) являются причиной всего спектра различий физиолого-биохимических признаков диссоциантов. У диссоциантов отмечена разная толщина и химический состав капсул (например, переход S- в R-вариант связан с потерей О- антигена). Клеточная стенка R-варианта в 1,5-2 раза толще, чем у S-формы. Разное количество в мембранах диссоциантов липидов, содержащих ненасыщенные жирные кислоты, влияет на их текучесть (например, R-вариант имеет меньше таких липидов, чем другие формы). Такие изменения в клеточных оболочках сказываются на функциональных параметрах: скорости роста и выделения продуктов, устойчивости к токсическим веществам и различным физико-химическим факторам, активности мембранных ферментов. Бóльшая устойчивость одного из диссоциантов к какому-либо фактору может привести к полной смене состава популяции к концу инкубационного периода.

Таким образом, на изменение условий популяция «отвечает» изменением соотношения диссоциативных вариантов, что способствует сохранению вида. Поэтому диссоциацию можно назвать адаптацией к меняющимся условиям среды на уровне популяции.

В природных местообитаниях обычно наблюдают преобладание какого-то из диссоциантов, но отмечают наличие всех трех вариантов. Учет гетерогенности популяции позволяет прогнозировать поведение ряда патогенных микроорганизмов при изменении условий.

Явление диссоциации следует учитывать при проведении процессов в микробиологических производствах, так как при длительном культивировании медленно растущие варианты вытесняются быстро растущими, но, как правило, менее активными диссоциантами. К тому же диссоцианты могут синтезировать разное количество биологически активных веществ, спектр которых может различаться. У М-клеток, как правило, образуется максимальное количество экзопродуктов, R-варианты активнее разрушают ксенобиотики, так как они устойчивее к токсическим веществам. Условия хранения продуцента также оказывают существенное влияние на состав его популяции.

Для стабилизации синтеза биологически активных веществ в промышленности необходимо: 1) соблюдать оптимальные условия хранения продуцента; 2) соблюдать оптимальные для высокопродуктивного диссоцианта условия роста; 3) постоянно вести стабилизирующий отбор; 4) получить недиссоциирующий клон. Исследования процесса диссоциации имеют прогностическую ценность и дают возможность управлять течением процесса.

Показано, что в диссоциации изученных микроорганизмов могут быть задействованы все генетические процессы – трансформация, трансдукция, фаговая конверсия, мигрирующие генетические элементы (умеренные фаги, плазмиды, транспозоны).

↑Генетически модифицированные микроорганизмы

Живые организмы, наследственный материал которых целенаправленно изменен с помощью генно-инженерных методов, называют генетически модифицированными организмами (ГМО). Целью создания любого ГМО является улучшение полезных свойств исходного организма, а также дополнение их рядом необычных характеристик, часто присущих организмам других систематических групп. Для генетической модификации в настоящее время чаще всего применяют перенос фрагментов ДНК из других микроорганизмов в организм-продуцент (получение трансгенных организмов).

Значительную часть ГМО составляют генетически модифицированные микроорганизмы (ГЕМОМ). В качестве векторов прокариот используют плазмиды и фаги. Поскольку микробные клетки относительно просто устроены, быстро растут и легко подвергаются «конструированию», то ГЕМОМ широко используются в фундаментальных научных исследованиях и прикладных областях. Современная наука использует ГЕМОМ в качестве моделей для решения ряда проблем биологии и медицины (процессы старения и регенерации, закономерности развития некоторых заболеваний и т.д.). Для биотехнологических производств ГЕМОМ – это перспективные продуценты ценных веществ. При помощи генетически модифицированных микроорганизмов получают пищевые добавки, аминокислоты, витамины, ароматизаторы, ферменты, фармацевтические препараты, вакцины, а также некоторые дорогостоящие соединения, ранее производимые путем традиционного химического синтеза. Методами генной инженерии удается не только увеличить продуктивность процесса и удешевить его, но и получить микробиологическим путем необычные для микробного метаболизма продукты при физиологических условиях. Замена химического синтеза на биологический привлекательна с точки зрения экологической безопасности и использования возобновляемых природных источников. Международные стандарты качества производства (GMP) требуют, чтобы после завершающей стадии очистки конечный продукт не содержал микробной ДНК.

В последнее время растет число ГЕМОМ, предлагаемых для разрушения различных загрязнений как в природных местообитаниях, так и в искусственных очистных установках. Новое направление генно-инженерных разработок – это создание микроорганизмов-пробиотиков с заданными свойствами на основе молочнокислых бактерий. Получены штаммы с повышенной активностью использования лактозы и гидролиза белков молока, обладающие устойчивостью к бактериофагам. Перенос генов из неродственных штаммов позволяет «добавить» молочнокислым микроорганизмам ряд дополнительных возможностей (например, способность к образованию a-кетоглутарата из глутамата).

Потенциальные проблемы, возникающие при неконтролируемом внесении ГЕМОМ в окружающую среду, вызвали широкие дебаты в научном сообществе, вовлекая правительственные органы и поборников защиты окружающей среды. Основной вопрос заключался в том, как долго ГЕМОМ и их ДНК будут существовать в окружающей природе и смогут ли модифицированные гены от ГЕМОМ быть переданы аборигенным микроорганизмам. Первоначальные эксперименты показали, что ГЕМОМ быстро отмирают при внесении в природные ценозы, поскольку не способны конкурировать с существующими сообществами микроорганизмов. Предполагали, что чужеродная ДНК, внесенная в ГЕМОМ, снижает конкурентоспособность живых клеток по сравнению с « дикими» штаммами из-за больших энергетических затрат на репликацию ДНК. Это предположение было подтверждено при изучении выживания в почве ГЕМОМ Pseudomonas sp. с введенной плазмидой, несущей гены расщепления мощного гербицида, 2,4,5-трихлорфеноксиацетата. Клетки ГЕМОМ-псевдомонад быстро исчезали из почвенного образца и через несколько дней не обнаруживались при прямых высевах на среды. Однако спустя несколько недель ГЕМОМ-псевдомонады вновь можно было обнаружить в образце, что говорит о том, что они не отмирали полностью. Результаты этих и последующих экспериментов показали, что модифицированные псевдомонады могут жить в почве в течение длительного времени. Другие наблюдения показали существование ГЕМОМ в почвенных и водных экосистемах в виде некультивируемых форм бактерий. Специальные исследования также показали, что ДНК разрушенных ГЕМОМ-клеток, адсорбированная на частицах почвенной глины, устойчива к действию ДНКаз и может существовать в таком «иммобилизованном» виде достаточно долго, а затем быть вовлечена в процесс трансформации. Гены в почвенных и водных экосистемах могут быть также перенесены в результате трансдукции. Так, через год после введения в водную экосистему специфического штамма Pseudomonas sp. В13 в ней были обнаружены виды, расщепляющие 3-хлорбензол (3-ХБ), которые ранее из этой экониши не выделялись. Более того, в геноме нового изолята были обнаружены последовательности, принадлежащие штамму В13. Предполагают, что новый штамм возник в результате обмена частью генома между аборигенной бактерией и внесенным штаммом В13, не способным утилизировать 3-ХБ. Таким образом, перенос генетического материала в природных нишах возможен в течение значительного времени после введения чужеродных генов, и следствием этого может быть изменение пула генов микробиоты данной экосистемы, что отразится на биоразнообразии и стабильности данного сообщества.

Еще одна проблема - это использование при получении ГМО маркерных микробных генов устойчивости к антибиотикам, которые могут перейти к микробиоте кишечника, что приведет к невозможности лечения многих заболеваний с помощью антибиотиков. В связи с этим с декабря 2004 г. в странах ЕС запрещена продажа ГМО с микробными генами устойчивости к антибиотикам.

Любая интродукция ГЕМОМ в природные экониши опасна из-за возможности горизонтального переноса рекомбинантных генов от ГЕМОМ к другим представителям микробного сообщества. Ситуация осложняется отсутствием адекватных методов выявления и контроля над распространением ГЕМОМ в окружающей среде. Одним из путей может быть внедрение в переносимый наследственный материал генов «программируемой клеточной смерти», которые будут экспрессироваться после того, как функция ГЕМОМ в данном местообитании будет выполнена. Если эти гены будет нести рекомбинантная плазмида, то ее передача другому микроорганизму будет вызывать его гибель. Тем самым решается проблема распространения этих плазмид в окружающей среде.